市场监管总局关于发布《食品中大黄酚和橙黄决明素的测定》等2项食品补充检验方法的公告
市场监管总局关于发布《食品中大黄酚和橙黄决明素的测定》等
2项食品补充检验方法的公告
2019年第46号
2项食品补充检验方法的公告
2019年第46号
按照《食品补充检验方法工作规定》有关要求，《食品中大黄酚和橙黄决明素的测定》和《食品中番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚的测定》2项食品补充检验方法已经市场监管总局批准，现予发布。
特此公告。
附件：1.食品中大黄酚和橙黄决明素的测定 （BJS 201916）
2.食品中番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚的测定 （BJS 201917）
市场监管总局
2019年10月18日
2019年10月18日
附件1
食品中大黄酚和橙黄决明素的测定
BJS 201916
1范围
本方法规定了食品（含保健食品）中大黄酚和橙黄决明素的高效液相色谱测定方法。
本方法适用于饮料、代用茶等食品及片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等剂型的保健食品中大黄酚和橙黄决明素的含量测定。
2原理
试样经甲醇回流提取后，再以稀盐酸水解，二氯甲烷萃取，采用配有二极管阵列检测器或紫外检测器的高效液相色谱仪检测，外标法定量。
3试剂和材料
除另有说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1甲醇（CH3OH)：色谱纯。
3.1.2 乙腈（C2H3N）：色谱纯。
3.1.3磷酸（H3PO4）。
3.1.4二氯甲烷（CH2CL2）。
3.1.5 盐酸（HCL）。
3.1.6 无水乙醇（CH3CH2OH）。
3.1.7乙酸乙酯（C4H8O2）。
3.1.8 甲酸（CH2O2）。
3.2 试剂配制
3.2.1 磷酸水溶液（0.1%）：取磷酸（3.1.3）1.0mL，加水定容至1000mL。
3.2.2 稀盐酸：取盐酸（3.1.5）234mL，用水溶解并定容至1000mL。
3.2.3 无水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液：取无水乙醇500mL与乙酸乙酯250mL，混匀。
3.2.4甲酸水溶液（0.1%）：取甲酸（3.1.8）1.0mL，加水稀释并定容至1000mL。
3.3 标准品
橙黄决明素、大黄酚的标准品的分子式、相对分子量、CAS登录号见附录A表A.1。橙黄决明素的纯度≥98%，大黄酚的纯度≥99%。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备液(100μg/mL)：分别称取大黄酚、橙黄决明素（3.3）各0.0100g（精确至0.0001g），置100mL棕色量瓶中，用无水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液（3.2.3）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/mL的标准储备液，0～4℃冷藏保存，有效期6个月。
3.4.2混合标准中间液（20μg/mL）：分别准确吸取大黄酚、橙黄决明素标准储备液(100μg/mL)(3.4.1)各5mL，置同一25mL棕色量瓶中，用无水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液（3.2.3）稀释至刻度，摇匀。0～4℃冷藏保存，有效期1个月。
3.4.3 混合标准工作液：分别准确吸取不同体积的混合标准中间液，用无水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液（3.2.3）稀释成一系列标准工作液，该标准系列中大黄酚和橙黄决明素浓度为0.2μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、10.0μg/mL 、20.0μg/mL。临用新制。
4仪器和设备
4.1 高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
4.2 超声波清洗器。
4.3 高速万能粉碎机。
4.4 分析天平：感量分别为0.01g和0.01mg。
4.5 电热恒温水浴锅。
4.6 旋转蒸发仪。
4.7 氮吹仪。
5分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 固态试样或半固态试样
取适量固态试样（代用茶及片剂、胶囊内容物、颗粒剂等保健食品）混匀，研细，或取适量半固态试样（软胶囊内容物）混匀，称取0.5g～1g（精确至0.001g），置平底烧瓶中，加入甲醇50mL，混匀，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25mL于平底烧瓶中，蒸干（或氮吹至干），加入稀盐酸（3.2.2）30mL，超声2min，加热回流水解1h，立即冷却，置于分液漏斗中，先用少量水洗涤烧瓶，再用少量二氯甲烷洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，酸液再用二氯甲烷振摇提取4次，用量依次为40mL、30mL、30mL、20mL，合并二氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液（3.2.3）溶解，转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，溶液经0.45µm有机系微孔滤膜滤过，取续滤液，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，备用。
5.1.2 液态试样
取适量试样（饮料、口服液）混匀，准确吸取2.0～5.0mL，置平底烧瓶中，水浴蒸干，加入稀盐酸（3.2.2）10mL，超声2min，加热回流水解1h，立即冷却，置于分液漏斗中，用少量水洗涤烧瓶，再用少量二氯甲烷洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，酸液再用二氯甲烷振摇提取4次，用量依次为15mL、10mL、10mL、10mL，合并二氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液（3.2.3）溶解，转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，溶液经0.45µm有机系微孔滤膜滤过，取续滤液，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，备用。
5.2 色谱参考条件
5.2.1色谱柱：BDS HYPERSIL C18（4.6mm×250mm, 5μm）或性能相当者。
5.2.2流动相：A相为甲醇，B相为0.1%磷酸水溶液(3.2.1)，洗脱梯度程序见表1。
5.2.3流速：1.0mL/min。
5.2.4柱温：30℃。
5.2.5检测波长：284nm。
5.2.6进样量：10μL。
表1 梯度洗脱程序表
梯度时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 60 40
15 60 40
22 90 10
32 90 10
37 60 40
40 60 40
5.3 标准曲线的制作
将标准系列工作液（3.4.3）按液相色谱参考条件（5.2）进行测定，测定相应的色谱峰面积，以标准工作液的浓度（μg/mL）为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4 试样溶液的测定
将试样溶液（5.1）按液相色谱参考条件（5.2）进行测定，得到相应样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。
6结果计算
固态或半固态试样中大黄酚和橙黄决明素含量按式（1）计算：
……………………………………………（1）
式中：
X—试样中大黄酚或橙黄决明素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
C—试样中所测的大黄酚或橙黄决明素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V—试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；
V1—最初加入甲醇的体积，单位为毫升（mL）；
V0—试样加酸水解前取滤液体积，单位为毫升（mL）；
m—试样称取的质量，单位为克（g）；
液态试样中大黄酚和橙黄决明素含量按式（2）计算：
……………………………………………………（2）
式中：
X—试样中大黄酚或橙黄决明素的含量，单位为毫克每升（mg/L）；
C—试样中所测的大黄酚或橙黄决明素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V—试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；
V0—试样吸取体积，单位为毫升（mL）；
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
7 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8 检出限
固体或半固体试样：当称样量为0.5g时，该方法测定条件下，橙黄决明素和大黄酚的检出限均为4mg/kg，定量限为12mg/kg。
液体试样：当取样量为5mL时，该方法测定条件下，橙黄决明素和大黄酚的检出限均为0.2mg/L，定量限为0.6mg/L。
附录A
化合物相关信息
表A.1 大黄酚和橙黄决明素标准品的中、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量
大黄酚 Chrysophanol 481-74-3 C15H10O4 254.23
橙黄决明素 Aurantio-obtusin 67979-25-3 C17H14O7 330.29
附录B
大黄酚和橙黄决明素标准溶液色谱图
图B.1 混合标准品溶液色谱图
1.橙黄决明素；2.大黄酚
附录C
定性确证试验
C.1. 色谱参考条件
a)色谱柱：C18柱，1.7μm，100×3.0mm（内径），或性能相当者。
b)流动相：A相为 0.1%甲酸水溶液（3.2.4）；B相为乙腈（3.1.2）；A+B=40+60。
c)流速：0.3mL/min。
d)柱温：35℃。
e)进样量：1μL。
C.2 质谱参考条件
f)离子源：电喷雾离子源(ESI)。
g)检测方式：多反应监测 (MRM)。
h)扫描方式：正离子扫描(ESI+)。
i)毛细管电压：3000V。
j)喷嘴电压：1500V。
k)雾化气温度：200℃。
l)雾化气流速：14.0 L/min。
m)雾化气压力：20psi。
n)鞘气流速：11.0L/min。
o)鞘气温度：250℃。
p)其他质谱参数见表C.1。
表C.1化合物定性、定量离子和质谱分析参数
序号 化合物名称 电离方式 母离子 ( m/z) 子离子 (m/z) 碰撞能量(V) 保留时间（min）
1 橙黄决明素 ESI+ 330.8 297.8* 28 1.298
269.8
2 大黄酚 ESI+ 254.9 151.9* 40 4.277
180.6
* 定量离子。
注： 1.本方法提供质谱条件为推荐质谱方法条件。可根据实际情况，选择响应信号强且无干扰的离子对进行检测，质谱参数亦可根据实际可达到最优灵敏度的条件进行设定。
2.如实际样品中有检出，通过保留时间及DAD光谱图不能准确定性，可以附录C超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法进行确证。
C.3 定性判定
按照C.1和C.2 的条件测定样品和混合标准系列工作溶液，记录样品和混合标准系列工作溶液中目标物的保留时间。若样品中检出与混合标准系列工作溶液中待测物保留时间一致的色谱峰（变化范围在±2.5%之内），且其定性离子与浓度相当的标准溶液中相应的定性离子的相对丰度相比偏差不超过表2规定的范围，则可以确定样品中检出相应的待测物。
表C.2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度（%） k＞50% 50%≥k＞20% 20%≥k＞10% k≤10%
允许的最大偏差（%） ± 20 ± 25 ± 30 ± 50
C.4标准色谱图
图C.1 橙黄决明素和大黄酚标准物质的总离子流色谱图
图C.2 橙黄决明素和大黄酚两种标准物质的提取离子色谱图
本方法负责起草单位：山东省食品药品检验研究院。
方法的参与验证单位：山西省食品药品检验所、河北省药品检验研究院、上海市食品药品检验所、福建省食品药品质量检验研究院、济南市食品药品检验检测中心。
主要起草人：刁飞燕、李启艳、卢端萍、郑荣、齐红、徐敦明。
附件2
食品中番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚的测定
BJS 201917
1范围
本方法规定了食品（含保健食品）中番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚含量的高效液相色谱-串联质谱测定方法。
本方法适用于饮料、代用茶等食品及片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等剂型的保健食品中番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚含量的测定。
2原理
试样经甲醇-甲酸铵溶液（9:1）超声提取、离心、过滤后，滤液供高效液相色谱-质谱联用仪测定，外标法定量。
3试剂和材料
注：水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
3.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.3 甲酸铵（CH5NO2）：色谱纯。
3.2 试剂配制
3.2.1 甲酸溶液（0.1%）：取甲酸（3.1.1）1.0mL用水稀释至1000mL。
3.2.2 甲酸铵溶液(2mmoL/L)：称取甲酸铵（3.1.3）0.13g（精确至0.01g），溶于水并稀释至1L。
3.2.3 甲醇-甲酸铵溶液（9:1）：取甲醇（3.1.2）900mL，加入100mL甲酸铵溶液（3.2.2），混匀。
3.3 标准物质
番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1。番泻苷B和番泻苷A的纯度均≥95.0%，大黄素甲醚纯度≥99.0%。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 番泻苷A标准储备液（40μg/mL）：准确称取番泻苷A（3.3）10.0mg(精确至0.0001g)，置250mL量瓶中，加入甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）200mL，超声（40℃）使溶解，冷却至室温，用甲醇-甲酸铵溶液定容至刻度，摇匀，制成浓度为40μg/mL标准储备液，-20℃保存，保存期3个月。
3.4.2 番泻苷B标准储备液（40μg/mL）：准确称取番泻苷B（3.3）10.0mg(精确至0.0001g)，置250mL量瓶中，加入甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）200mL，使其溶解，用甲醇-甲酸铵溶液定容至刻度，摇匀，制成浓度为40μg/mL标准储备液，-20℃保存，保存期3个月。
3.4.3 大黄素甲醚标准储备液（40μg/mL）：准确称取大黄素甲醚（3.3）10.0mg(精确至0.0001g)，置250mL量瓶中，加入甲醇（3.1.2）200mL，超声（40℃）使溶解，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为40μg/mL标准储备液，-20℃保存，保存期3个月。
3.4.4混合标准中间液（10μg/mL）：分别准确吸取番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚标准储备液(40μg/mL)各 2.5mL，用甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）稀释至10mL，摇匀，制成10μg/mL的混合标准中间液，-20℃保存，保存期1个月。
3.4.5混合标准系列工作液的制备：分别准确吸取混合标准中间液（10μg/mL）（3.4.4）适量，用甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）稀释，摇匀，作为系列混合标准工作溶液，浓度依次为各化合物0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、 2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL，临用新制或依仪器响应情况配制适当浓度的混合标准工作溶液。或根据需要采用空白基质提取液（5.1.3），配制适当浓度的基质混合标准工作溶液。
4 仪器和设备
4.1 高效液相色谱-质谱联用仪，配有电喷雾（ESI）离子源。
4.2 天平：感量分别为0.00001g和0.0001g。
4.3 超声波清洗器。
4.4 涡旋混匀器。
4.5 离心机：转速≥3000r/min。
5 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 固态试样或半固态试样
取适量固态试样（代用茶及片剂、胶囊内容物、颗粒剂等保健食品）混匀，研细，或取适量半固态试样（软胶囊）内容物混匀，准确称取1.0g（精确至0.001g），置100mL量瓶中，加入甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）80mL，涡旋混匀1 min，超声（40℃）提取60min，冷却至室温，用甲醇-甲酸铵溶液（9:1）定容至刻度，摇匀，以3000r/min离心5min，取适量上清液过0.22 μm有机滤膜，取续滤液，待测。
5.1.2 液态试样
取适量试样（饮料、口服液）混匀，准确量取1.0mL，置100mL量瓶中，加入甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）80mL，涡旋混匀1min，超声（40℃）提取60min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，以3000r/min离心5min，取适量上清液过0.22μm有机滤膜，取续滤液，待测。
5.1.3 空白基质提取液
称取空白试样适量，与试样同法处理，制得空白基质提取液。
5.1.4 空白溶液
不加试样，与试样同法处理，制得空白溶液。
5.2 仪器参考条件
5.2.1 色谱参考条件
a）色谱柱：C18（2.1×50mm，1.8µm），或性能相当者。
b）流动相：A相为甲醇（3.1.2），B相为0.1%甲酸溶液（3.2.1），梯度洗脱程序见表1。
c）流速：0.2mL/min。
d）柱温：40℃。
e）进样量：2μL。
表1 梯度洗脱程序表
梯度时间/min 流动相A/% 流动相B/%
0 25 75
10 25 75
15 60 40
18 90 10
25 90 10
26 25 75
28 25 75
5.2.2 质谱条件
a) 离子源：电喷雾离子源（ESI源）。
b）扫描方式：负离子扫描（ESI-）。
c) 检测方式：多反应离子监测（MRM）。
d) 干燥气、雾化气、加热气等均为高纯氮气，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，干燥气流速、加热气流速、雾化气流速、接口温度、脱溶剂管温度、加热器温度、碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对等信息详见附录B。
5.3 定性测定
按照超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，当试样中检出与某标准品色谱峰保留时间一致的色谱峰（变化范围在±2.5%之内），并且试样色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比（k）的偏差不超过表2规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。
表2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度（%） k＞50% 50%≥k＞20% 20%≥k＞10% k≤10%
允许的最大偏差（%） ± 20 ± 25 ± 30 ± 50
5.4 定量测定
5.4.1 标准曲线的制作
将混合标准工作溶液（3.4.5）分别按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，以定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4.2 试样溶液的测定
将试样溶液（5.1.1-5.1.2）按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到样品溶液中对应组分的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。
对照品色谱图参见附录C。
5.4.3 空白溶液的测定
空白溶液（5.1.4） 同试样溶液测定步骤操作。
6 结果计算
将高效液相色谱-质谱联用仪测得浓度代入下式计算含量：
…………………………………………（1）
式中：
X — 试样中各待测物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg或mg/L）；
c — 从标准曲线中读出的各待测物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V — 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m — 试样的质量或体积，单位为克（g或mL）；
K — 稀释倍数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
8 其他
当称样量为1g（精确至0.001g）或1mL，定容体积为100mL时，番泻苷A的检出限为0.050mg/kg(mg/L)，定量限为0.200mg/kg(mg/L)。番泻苷B的检出限为0.050mg/kg(mg/L)，定量限为0.15mg/kg(mg/L)。大黄素甲醚的检出限为0.089mg/kg(mg/L)，定量限0.356mg/kg(mg/L)。
空白试验应无干扰。
附录A
化合物相关信息
表A.1 番泻苷A、番泻苷B、大黄素甲醚标准样品的中、英文名称、CAS登录号、
分子式、相对分子量
中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量
番泻苷A Sennoside A 81-27-6 C42H38O20 862.75
番泻苷B Sennoside B 128-57-4 C42H38O20 862.75
大黄素甲醚 Physcion 521-61-9 C16H12O5 284.27
附录B
质谱参考条件
质谱参考条件
a)离子源：电喷雾离子源(ESI) ；
b)检测方式：多反应监测 (MRM) ；
c)扫描方式：负离子扫描(ESI-)；
d)雾化气流速：3.0L/min；
e)加热气流速：10.0L/min；
f)干燥气流速：10.0L/min；
g)喷雾电压：4.5kV；
h)接口温度：300℃；
i)脱溶剂管温度：250℃；
j)加热器温度：400℃；
k)其他质谱参数见表B.1。
表B.1化合物定性、定量离子和质谱分析参数
序号 化合物名称 电离方式 母离子 ( m/z) 子离子 (m/z) 碰撞能量(V) 保留时间（min）
1 番泻苷B ESI- 861.4 386.2* 42 14.74
699.2 29
2 番泻苷A ESI- 861.4 386.2* 42 15.87
699.2 29
3 大黄素甲醚 ESI- 283.3 240.1* 25 21.09
183.2 53
* 定量离子。
附录C
标准色谱图
图C.1 番泻苷B、番泻苷A、大黄素甲醚标准物质的总离子流色谱图
（1-番泻苷B；2-番泻苷A；3-大黄素甲醚，以下同）
图C.2 番泻苷B、番泻苷A标准物质的提取定量离子色谱图
图C.3 番泻苷B、番泻苷A标准物质的提取定性离子色谱图
图C.4 大黄素甲醚标准物质的提取定量离子色谱图
图C.5 大黄素甲醚标准物质的提取定性离子色谱图
本方法负责起草单位：山东省食品药品检验研究院。
方法的参与单位：中国食品药品检定研究院、山西省食品药品检验所、福建省食品药品质量检验研究院、河北省药品检验研究院、辽宁省食品检验检测院。
主要起草人为：李启艳、刁飞燕、曹进、卢端萍、高广慧、董培智。
食品中大黄酚和橙黄决明素的测定
BJS 201916
1范围
本方法规定了食品（含保健食品）中大黄酚和橙黄决明素的高效液相色谱测定方法。
本方法适用于饮料、代用茶等食品及片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等剂型的保健食品中大黄酚和橙黄决明素的含量测定。
2原理
试样经甲醇回流提取后，再以稀盐酸水解，二氯甲烷萃取，采用配有二极管阵列检测器或紫外检测器的高效液相色谱仪检测，外标法定量。
3试剂和材料
除另有说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1甲醇（CH3OH)：色谱纯。
3.1.2 乙腈（C2H3N）：色谱纯。
3.1.3磷酸（H3PO4）。
3.1.4二氯甲烷（CH2CL2）。
3.1.5 盐酸（HCL）。
3.1.6 无水乙醇（CH3CH2OH）。
3.1.7乙酸乙酯（C4H8O2）。
3.1.8 甲酸（CH2O2）。
3.2 试剂配制
3.2.1 磷酸水溶液（0.1%）：取磷酸（3.1.3）1.0mL，加水定容至1000mL。
3.2.2 稀盐酸：取盐酸（3.1.5）234mL，用水溶解并定容至1000mL。
3.2.3 无水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液：取无水乙醇500mL与乙酸乙酯250mL，混匀。
3.2.4甲酸水溶液（0.1%）：取甲酸（3.1.8）1.0mL，加水稀释并定容至1000mL。
3.3 标准品
橙黄决明素、大黄酚的标准品的分子式、相对分子量、CAS登录号见附录A表A.1。橙黄决明素的纯度≥98%，大黄酚的纯度≥99%。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备液(100μg/mL)：分别称取大黄酚、橙黄决明素（3.3）各0.0100g（精确至0.0001g），置100mL棕色量瓶中，用无水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液（3.2.3）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/mL的标准储备液，0～4℃冷藏保存，有效期6个月。
3.4.2混合标准中间液（20μg/mL）：分别准确吸取大黄酚、橙黄决明素标准储备液(100μg/mL)(3.4.1)各5mL，置同一25mL棕色量瓶中，用无水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液（3.2.3）稀释至刻度，摇匀。0～4℃冷藏保存，有效期1个月。
3.4.3 混合标准工作液：分别准确吸取不同体积的混合标准中间液，用无水乙醇-乙酸乙酯（2+1）混合溶液（3.2.3）稀释成一系列标准工作液，该标准系列中大黄酚和橙黄决明素浓度为0.2μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、10.0μg/mL 、20.0μg/mL。临用新制。
4仪器和设备
4.1 高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
4.2 超声波清洗器。
4.3 高速万能粉碎机。
4.4 分析天平：感量分别为0.01g和0.01mg。
4.5 电热恒温水浴锅。
4.6 旋转蒸发仪。
4.7 氮吹仪。
5分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 固态试样或半固态试样
取适量固态试样（代用茶及片剂、胶囊内容物、颗粒剂等保健食品）混匀，研细，或取适量半固态试样（软胶囊内容物）混匀，称取0.5g～1g（精确至0.001g），置平底烧瓶中，加入甲醇50mL，混匀，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25mL于平底烧瓶中，蒸干（或氮吹至干），加入稀盐酸（3.2.2）30mL，超声2min，加热回流水解1h，立即冷却，置于分液漏斗中，先用少量水洗涤烧瓶，再用少量二氯甲烷洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，酸液再用二氯甲烷振摇提取4次，用量依次为40mL、30mL、30mL、20mL，合并二氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液（3.2.3）溶解，转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，溶液经0.45µm有机系微孔滤膜滤过，取续滤液，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，备用。
5.1.2 液态试样
取适量试样（饮料、口服液）混匀，准确吸取2.0～5.0mL，置平底烧瓶中，水浴蒸干，加入稀盐酸（3.2.2）10mL，超声2min，加热回流水解1h，立即冷却，置于分液漏斗中，用少量水洗涤烧瓶，再用少量二氯甲烷洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，酸液再用二氯甲烷振摇提取4次，用量依次为15mL、10mL、10mL、10mL，合并二氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液（3.2.3）溶解，转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，溶液经0.45µm有机系微孔滤膜滤过，取续滤液，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，备用。
5.2 色谱参考条件
5.2.1色谱柱：BDS HYPERSIL C18（4.6mm×250mm, 5μm）或性能相当者。
5.2.2流动相：A相为甲醇，B相为0.1%磷酸水溶液(3.2.1)，洗脱梯度程序见表1。
5.2.3流速：1.0mL/min。
5.2.4柱温：30℃。
5.2.5检测波长：284nm。
5.2.6进样量：10μL。
表1 梯度洗脱程序表
梯度时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 60 40
15 60 40
22 90 10
32 90 10
37 60 40
40 60 40
5.3 标准曲线的制作
将标准系列工作液（3.4.3）按液相色谱参考条件（5.2）进行测定，测定相应的色谱峰面积，以标准工作液的浓度（μg/mL）为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4 试样溶液的测定
将试样溶液（5.1）按液相色谱参考条件（5.2）进行测定，得到相应样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。
6结果计算
固态或半固态试样中大黄酚和橙黄决明素含量按式（1）计算：
……………………………………………（1）
式中：
X—试样中大黄酚或橙黄决明素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
C—试样中所测的大黄酚或橙黄决明素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V—试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；
V1—最初加入甲醇的体积，单位为毫升（mL）；
V0—试样加酸水解前取滤液体积，单位为毫升（mL）；
m—试样称取的质量，单位为克（g）；
液态试样中大黄酚和橙黄决明素含量按式（2）计算：
……………………………………………………（2）
式中：
X—试样中大黄酚或橙黄决明素的含量，单位为毫克每升（mg/L）；
C—试样中所测的大黄酚或橙黄决明素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V—试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；
V0—试样吸取体积，单位为毫升（mL）；
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
7 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8 检出限
固体或半固体试样：当称样量为0.5g时，该方法测定条件下，橙黄决明素和大黄酚的检出限均为4mg/kg，定量限为12mg/kg。
液体试样：当取样量为5mL时，该方法测定条件下，橙黄决明素和大黄酚的检出限均为0.2mg/L，定量限为0.6mg/L。
附录A
化合物相关信息
表A.1 大黄酚和橙黄决明素标准品的中、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量
大黄酚 Chrysophanol 481-74-3 C15H10O4 254.23
橙黄决明素 Aurantio-obtusin 67979-25-3 C17H14O7 330.29
附录B
大黄酚和橙黄决明素标准溶液色谱图
图B.1 混合标准品溶液色谱图
1.橙黄决明素；2.大黄酚
附录C
定性确证试验
C.1. 色谱参考条件
a)色谱柱：C18柱，1.7μm，100×3.0mm（内径），或性能相当者。
b)流动相：A相为 0.1%甲酸水溶液（3.2.4）；B相为乙腈（3.1.2）；A+B=40+60。
c)流速：0.3mL/min。
d)柱温：35℃。
e)进样量：1μL。
C.2 质谱参考条件
f)离子源：电喷雾离子源(ESI)。
g)检测方式：多反应监测 (MRM)。
h)扫描方式：正离子扫描(ESI+)。
i)毛细管电压：3000V。
j)喷嘴电压：1500V。
k)雾化气温度：200℃。
l)雾化气流速：14.0 L/min。
m)雾化气压力：20psi。
n)鞘气流速：11.0L/min。
o)鞘气温度：250℃。
p)其他质谱参数见表C.1。
表C.1化合物定性、定量离子和质谱分析参数
序号 化合物名称 电离方式 母离子 ( m/z) 子离子 (m/z) 碰撞能量(V) 保留时间（min）
1 橙黄决明素 ESI+ 330.8 297.8* 28 1.298
269.8
2 大黄酚 ESI+ 254.9 151.9* 40 4.277
180.6
* 定量离子。
注： 1.本方法提供质谱条件为推荐质谱方法条件。可根据实际情况，选择响应信号强且无干扰的离子对进行检测，质谱参数亦可根据实际可达到最优灵敏度的条件进行设定。
2.如实际样品中有检出，通过保留时间及DAD光谱图不能准确定性，可以附录C超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法进行确证。
C.3 定性判定
按照C.1和C.2 的条件测定样品和混合标准系列工作溶液，记录样品和混合标准系列工作溶液中目标物的保留时间。若样品中检出与混合标准系列工作溶液中待测物保留时间一致的色谱峰（变化范围在±2.5%之内），且其定性离子与浓度相当的标准溶液中相应的定性离子的相对丰度相比偏差不超过表2规定的范围，则可以确定样品中检出相应的待测物。
表C.2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度（%） k＞50% 50%≥k＞20% 20%≥k＞10% k≤10%
允许的最大偏差（%） ± 20 ± 25 ± 30 ± 50
C.4标准色谱图
图C.1 橙黄决明素和大黄酚标准物质的总离子流色谱图
图C.2 橙黄决明素和大黄酚两种标准物质的提取离子色谱图
本方法负责起草单位：山东省食品药品检验研究院。
方法的参与验证单位：山西省食品药品检验所、河北省药品检验研究院、上海市食品药品检验所、福建省食品药品质量检验研究院、济南市食品药品检验检测中心。
主要起草人：刁飞燕、李启艳、卢端萍、郑荣、齐红、徐敦明。
附件2
食品中番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚的测定
BJS 201917
1范围
本方法规定了食品（含保健食品）中番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚含量的高效液相色谱-串联质谱测定方法。
本方法适用于饮料、代用茶等食品及片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等剂型的保健食品中番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚含量的测定。
2原理
试样经甲醇-甲酸铵溶液（9:1）超声提取、离心、过滤后，滤液供高效液相色谱-质谱联用仪测定，外标法定量。
3试剂和材料
注：水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
3.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.3 甲酸铵（CH5NO2）：色谱纯。
3.2 试剂配制
3.2.1 甲酸溶液（0.1%）：取甲酸（3.1.1）1.0mL用水稀释至1000mL。
3.2.2 甲酸铵溶液(2mmoL/L)：称取甲酸铵（3.1.3）0.13g（精确至0.01g），溶于水并稀释至1L。
3.2.3 甲醇-甲酸铵溶液（9:1）：取甲醇（3.1.2）900mL，加入100mL甲酸铵溶液（3.2.2），混匀。
3.3 标准物质
番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1。番泻苷B和番泻苷A的纯度均≥95.0%，大黄素甲醚纯度≥99.0%。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 番泻苷A标准储备液（40μg/mL）：准确称取番泻苷A（3.3）10.0mg(精确至0.0001g)，置250mL量瓶中，加入甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）200mL，超声（40℃）使溶解，冷却至室温，用甲醇-甲酸铵溶液定容至刻度，摇匀，制成浓度为40μg/mL标准储备液，-20℃保存，保存期3个月。
3.4.2 番泻苷B标准储备液（40μg/mL）：准确称取番泻苷B（3.3）10.0mg(精确至0.0001g)，置250mL量瓶中，加入甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）200mL，使其溶解，用甲醇-甲酸铵溶液定容至刻度，摇匀，制成浓度为40μg/mL标准储备液，-20℃保存，保存期3个月。
3.4.3 大黄素甲醚标准储备液（40μg/mL）：准确称取大黄素甲醚（3.3）10.0mg(精确至0.0001g)，置250mL量瓶中，加入甲醇（3.1.2）200mL，超声（40℃）使溶解，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为40μg/mL标准储备液，-20℃保存，保存期3个月。
3.4.4混合标准中间液（10μg/mL）：分别准确吸取番泻苷A、番泻苷B和大黄素甲醚标准储备液(40μg/mL)各 2.5mL，用甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）稀释至10mL，摇匀，制成10μg/mL的混合标准中间液，-20℃保存，保存期1个月。
3.4.5混合标准系列工作液的制备：分别准确吸取混合标准中间液（10μg/mL）（3.4.4）适量，用甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）稀释，摇匀，作为系列混合标准工作溶液，浓度依次为各化合物0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、 2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL，临用新制或依仪器响应情况配制适当浓度的混合标准工作溶液。或根据需要采用空白基质提取液（5.1.3），配制适当浓度的基质混合标准工作溶液。
4 仪器和设备
4.1 高效液相色谱-质谱联用仪，配有电喷雾（ESI）离子源。
4.2 天平：感量分别为0.00001g和0.0001g。
4.3 超声波清洗器。
4.4 涡旋混匀器。
4.5 离心机：转速≥3000r/min。
5 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 固态试样或半固态试样
取适量固态试样（代用茶及片剂、胶囊内容物、颗粒剂等保健食品）混匀，研细，或取适量半固态试样（软胶囊）内容物混匀，准确称取1.0g（精确至0.001g），置100mL量瓶中，加入甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）80mL，涡旋混匀1 min，超声（40℃）提取60min，冷却至室温，用甲醇-甲酸铵溶液（9:1）定容至刻度，摇匀，以3000r/min离心5min，取适量上清液过0.22 μm有机滤膜，取续滤液，待测。
5.1.2 液态试样
取适量试样（饮料、口服液）混匀，准确量取1.0mL，置100mL量瓶中，加入甲醇-甲酸铵溶液（9:1）（3.2.3）80mL，涡旋混匀1min，超声（40℃）提取60min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，以3000r/min离心5min，取适量上清液过0.22μm有机滤膜，取续滤液，待测。
5.1.3 空白基质提取液
称取空白试样适量，与试样同法处理，制得空白基质提取液。
5.1.4 空白溶液
不加试样，与试样同法处理，制得空白溶液。
5.2 仪器参考条件
5.2.1 色谱参考条件
a）色谱柱：C18（2.1×50mm，1.8µm），或性能相当者。
b）流动相：A相为甲醇（3.1.2），B相为0.1%甲酸溶液（3.2.1），梯度洗脱程序见表1。
c）流速：0.2mL/min。
d）柱温：40℃。
e）进样量：2μL。
表1 梯度洗脱程序表
梯度时间/min 流动相A/% 流动相B/%
0 25 75
10 25 75
15 60 40
18 90 10
25 90 10
26 25 75
28 25 75
5.2.2 质谱条件
a) 离子源：电喷雾离子源（ESI源）。
b）扫描方式：负离子扫描（ESI-）。
c) 检测方式：多反应离子监测（MRM）。
d) 干燥气、雾化气、加热气等均为高纯氮气，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，干燥气流速、加热气流速、雾化气流速、接口温度、脱溶剂管温度、加热器温度、碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对等信息详见附录B。
5.3 定性测定
按照超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，当试样中检出与某标准品色谱峰保留时间一致的色谱峰（变化范围在±2.5%之内），并且试样色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比（k）的偏差不超过表2规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。
表2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度（%） k＞50% 50%≥k＞20% 20%≥k＞10% k≤10%
允许的最大偏差（%） ± 20 ± 25 ± 30 ± 50
5.4 定量测定
5.4.1 标准曲线的制作
将混合标准工作溶液（3.4.5）分别按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，以定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4.2 试样溶液的测定
将试样溶液（5.1.1-5.1.2）按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到样品溶液中对应组分的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。
对照品色谱图参见附录C。
5.4.3 空白溶液的测定
空白溶液（5.1.4） 同试样溶液测定步骤操作。
6 结果计算
将高效液相色谱-质谱联用仪测得浓度代入下式计算含量：
…………………………………………（1）
式中：
X — 试样中各待测物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg或mg/L）；
c — 从标准曲线中读出的各待测物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V — 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m — 试样的质量或体积，单位为克（g或mL）；
K — 稀释倍数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
8 其他
当称样量为1g（精确至0.001g）或1mL，定容体积为100mL时，番泻苷A的检出限为0.050mg/kg(mg/L)，定量限为0.200mg/kg(mg/L)。番泻苷B的检出限为0.050mg/kg(mg/L)，定量限为0.15mg/kg(mg/L)。大黄素甲醚的检出限为0.089mg/kg(mg/L)，定量限0.356mg/kg(mg/L)。
空白试验应无干扰。
附录A
化合物相关信息
表A.1 番泻苷A、番泻苷B、大黄素甲醚标准样品的中、英文名称、CAS登录号、
分子式、相对分子量
中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量
番泻苷A Sennoside A 81-27-6 C42H38O20 862.75
番泻苷B Sennoside B 128-57-4 C42H38O20 862.75
大黄素甲醚 Physcion 521-61-9 C16H12O5 284.27
附录B
质谱参考条件
质谱参考条件
a)离子源：电喷雾离子源(ESI) ；
b)检测方式：多反应监测 (MRM) ；
c)扫描方式：负离子扫描(ESI-)；
d)雾化气流速：3.0L/min；
e)加热气流速：10.0L/min；
f)干燥气流速：10.0L/min；
g)喷雾电压：4.5kV；
h)接口温度：300℃；
i)脱溶剂管温度：250℃；
j)加热器温度：400℃；
k)其他质谱参数见表B.1。
表B.1化合物定性、定量离子和质谱分析参数
序号 化合物名称 电离方式 母离子 ( m/z) 子离子 (m/z) 碰撞能量(V) 保留时间（min）
1 番泻苷B ESI- 861.4 386.2* 42 14.74
699.2 29
2 番泻苷A ESI- 861.4 386.2* 42 15.87
699.2 29
3 大黄素甲醚 ESI- 283.3 240.1* 25 21.09
183.2 53
* 定量离子。
附录C
标准色谱图
图C.1 番泻苷B、番泻苷A、大黄素甲醚标准物质的总离子流色谱图
（1-番泻苷B；2-番泻苷A；3-大黄素甲醚，以下同）
图C.2 番泻苷B、番泻苷A标准物质的提取定量离子色谱图
图C.3 番泻苷B、番泻苷A标准物质的提取定性离子色谱图
图C.4 大黄素甲醚标准物质的提取定量离子色谱图
图C.5 大黄素甲醚标准物质的提取定性离子色谱图
本方法负责起草单位：山东省食品药品检验研究院。
方法的参与单位：中国食品药品检定研究院、山西省食品药品检验所、福建省食品药品质量检验研究院、河北省药品检验研究院、辽宁省食品检验检测院。
主要起草人为：李启艳、刁飞燕、曹进、卢端萍、高广慧、董培智。
