食品检验员稀释平板菌落计数法
食品检验员掌握稀释平板菌落计数法（也称倾注平板法或平板计数法）是其进行食品中微生物（细菌、酵母、霉菌）总量测定的核心技能。该方法依据国家标准（如GB 4789.2《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》），通过将样品进行一系列梯度稀释，使样品中的微生物细胞分散开，然后与熔化的琼脂培养基混合并倾注成平板，经培养后，由单个活细胞生长繁殖形成的菌落形成单位 (CFU, Colony Forming Unit) 可以被计数，从而计算出原始样品中的微生物数量。
这是一种活菌计数法，结果以菌落形成单位每克或每毫升 (CFU/g 或 CFU/mL) 表示。
一、 方法原理
稀释：将待测样品制成均匀的悬液，并进行10倍系列稀释（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³...），目的是将高浓度的微生物稀释到可在平板上清晰计数的范围（30-300 CFU/平板）。
接种与混合：取一定量（通常1 mL）的适宜稀释度的菌液，加入无菌培养皿中。
倾注：将冷却至约46°C（不烫手，可防止烫死微生物）的熔化琼脂培养基（如营养琼脂NA用于细菌，马铃薯葡萄糖琼脂PDA用于酵母和霉菌）迅速倾注入培养皿中。
混匀：立即轻轻旋转培养皿，使菌液与琼脂充分、均匀混合。
凝固与培养：待琼脂凝固后，将平板倒置（防止冷凝水滴落冲散菌落），放入恒温培养箱中，在规定温度和时间下培养。
计数与计算：培养结束后，计数平板上的菌落数，根据稀释倍数和接种量计算出原始样品中的微生物浓度。
二、 标准操作流程
1. 样品准备
固体/半固体样品：称取25g样品，加入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液（pH 7.0），在均质袋或灭菌乳钵中充分研磨或使用拍击式均质器均质，制成1:10 (10⁻¹) 的均匀稀释液。
液体样品：直接用无菌吸管吸取，作为原液（10⁰）或进行稀释。
2. 系列稀释
取1 mL 10⁻¹稀释液，加入盛有9 mL无菌生理盐水的试管中，振荡混匀，得到10⁻²稀释液。
换用新吸管，取1 mL 10⁻²稀释液，加入另一支9 mL稀释液的试管中，混匀，得到10⁻³稀释液。
重复此过程，根据样品污染程度，制备至10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶等稀释度。每稀释一步，必须更换无菌吸管或枪头，防止交叉污染。
3. 倾注平板
选择稀释度：根据经验或预实验，选择2-3个连续的适宜稀释度（预期平板菌落数在30-300之间）。
标记培养皿：提前标记好样品名称、稀释度、日期。
加样：用无菌吸管分别吸取1.0 mL各选定稀释度的菌液，分别加入两个无菌培养皿中（做平行）。
倾注琼脂：
将装有琼脂的三角瓶置于46°C水浴中保温。
取出，摇匀（使可能沉降的成分分散）。
迅速向每个培养皿中倾注约15-20 mL熔化的琼脂培养基。
混匀：立即盖上皿盖，在桌面上轻轻、平稳地向一个方向旋转，使菌液与琼脂充分混合。避免产生气泡。
凝固：静置，待琼脂完全凝固（约10-15分钟）。
4. 培养
倒置平板：将凝固的平板倒置放入恒温培养箱。
培养条件：
细菌菌落总数：36±1°C，培养 48±2小时。
酵母和霉菌总数：25-28°C，培养 5天（按GB 4789.15）。
5. 菌落计数
选择平板：选择菌落数在 30-300 CFU 之间的平板进行计数。若所有平板均多于300，取稀释度最高的计数；若均少于30，取稀释度最低的计数。
计数方法：
使用菌落计数器或放大镜。
对于均匀分布的菌落，可直接计数。
对于片状生长或蔓延菌落，该平板不宜计数。
对于链状菌落，无明显单个菌落时，一条链计为一个菌落。
计算：
C：两平板菌落总数之和
n₁, n₂：两平板个数（均为1）
d：稀释倍数
最终结果保留两位有效数字。
若两个平行平板的菌落数均在30-300之间：
结果 = (C / (n₁ + n₂)) × d
若只有一个平板在30-300之间：直接用该平板菌落数乘以稀释倍数。
若所有平板均>300：报告“>300 × 最高稀释倍数”。
若所有平板均<30：报告“<30 × 最低稀释倍数”。
若空白对照平板有菌落：此次实验无效，需重做。
6. 报告结果
以 CFU/g（固体样品）或 CFU/mL（液体样品）表示。
例如：1.5×10⁴ CFU/g。
三、 食品检验员注意事项
无菌操作是生命线：所有操作必须在超净工作台内进行，器皿、试剂、吸管必须无菌，防止外来污染。
稀释准确性：
稀释液必须充分混匀（振荡或拍打）。
每步稀释必须更换吸管或枪头，这是保证稀释准确的关键。
琼脂温度控制：
温度过高（>50°C）会烫死部分微生物。
温度过低（<45°C）会提前凝固，无法混合均匀。
必须使用恒温水浴锅精确控制。
混合均匀：倾注后必须立即充分旋转混匀，否则菌落会集中在底部或一侧。
防止冷凝水：培养时平板必须倒置，避免冷凝水滴落导致菌落蔓延或冲散。
培养条件：严格按标准控制温度和时间。酵母霉菌需较长培养时间。
结果解读：
菌落总数反映的是可培养的、在特定条件下生长的活菌数，并非样品中所有微生物的总数。
结果受样品处理、稀释、培养基、培养条件等多种因素影响。
安全防护：处理未知样品时，佩戴手套、口罩、实验服，避免直接接触和吸入气溶胶。实验后对废弃物进行高压灭菌处理。
四、 方法优缺点
| 优点 | 缺点 |
|---|---|
| 结果直观：能看到菌落形态，便于初步判断。 | 操作繁琐：步骤多，耗时长。 |
| 可计数活菌：只计数能生长繁殖的活细胞。 | 只能计数可培养菌：大量不可培养的“VBNC”（活的非可培养）状态微生物无法检出。 |
| 应用广泛：适用于大多数食品的菌落总数、大肠菌群、霉菌酵母计数。 | 结果受培养基和条件限制：不同微生物生长要求不同。 |
| 符合国家标准：是法定的常规检测方法。 | 易受操作误差影响：稀释、混合不均等都会影响结果。 |
五、 总结
稀释平板菌落计数法是食品检验员进行微生物定量检测的“金标准”方法之一。其核心在于通过精确的系列稀释和无菌操作，将样品中的微生物分散并固定在琼脂平板中，通过培养后计数形成的菌落来反推原始样品的微生物负荷。
