食品检验员掌握粮粒内部霉菌的分离技术，是其深入探究粮食真菌污染源头、评估粮食贮藏安全性、研究抗病品种以及进行真菌毒素风险评估的关键能力。与仅检测表面霉菌不同，内部霉菌的分离旨在获取已侵入粮粒组织内部（如胚、胚乳、种皮下）的霉菌，这些霉菌往往是导致粮食深层霉变、品质劣变和毒素积累的“元凶”。

一、 目的与意义

溯源污染：区分霉菌是来自外部污染（如灰尘、虫尸）还是内部侵染（如收获前田间感染、贮藏中从裂缝侵入）。

评估真实风险：内部霉菌更难通过常规清理去除，且持续代谢产毒，是食品安全的核心风险点。

研究抗病性：比较不同品种粮食对霉菌侵染的抵抗能力。

分离纯种：为后续的菌种鉴定、产毒能力测定、分子生物学研究提供纯净菌株。

二、 基本原理

利用表面除菌技术杀灭或去除粮粒表面附着的微生物，然后将处理后的粮粒置于适宜的培养基上培养。如果培养基上长出霉菌，则表明该霉菌来源于粮粒内部，在表面消毒过程中未被杀死，并能在培养条件下生长。

三、 标准操作流程

1. 样品选择与准备

选择：选取外观无明显霉变、无破损、无虫蛀的粮粒。避免选择已发霉的颗粒，因其内外菌混杂，难以区分。

数量：根据检验目的确定，通常每份样品处理20-50粒。

清洗：用无菌水轻轻冲洗，去除浮尘。

2. 表面除菌（关键步骤）

目的：彻底杀灭表面微生物，确保后续长出的菌来自内部。

方法（推荐次氯酸钠法）：

将粮粒浸入 1-2% 次氯酸钠溶液中，处理 1-3分钟（时间根据粮粒大小和种皮厚度调整，如小麦1.5分钟，稻谷2分钟）。

立即用大量无菌蒸馏水冲洗 4-5次，彻底去除残留消毒剂。

可在最后一次漂洗水中加入少量无菌吐温-80（0.05%）以助去除疏水性残留。

替代方法：70%乙醇浸泡30秒-1分钟，同样需充分漂洗。

3. 干燥

将漂洗后的粮粒铺在无菌滤纸上，在超净工作台内用无菌风吹干，或置于无菌环境中自然晾干。

避免高温烘干，以免杀死内部霉菌或使粮粒开裂。

4. 接种与培养

方法一：直接压入法（推荐，保持粮粒完整性）

将马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 或孟加拉红培养基平板稍融化（约45°C水浴），倒入培养皿，凝固。

用无菌镊子夹取1-2粒已干燥的粮粒，轻轻压入琼脂表面，使其1/2至2/3嵌入琼脂，但不要完全埋入。

盖上皿盖，倒置培养。

方法二：表面放置法

将干燥的粮粒直接放置在已凝固的PDA平板表面。

轻轻按压，使其与琼脂接触良好。

倒置培养。

培养条件：

温度：25-28°C（适合大多数霉菌生长）。

时间：5-7天，甚至更长（霉菌生长较慢）。

光照：部分霉菌产孢需要光照，可采用12小时光照/12小时黑暗的光暗循环。

5. 观察与分离纯化

观察：

每日观察，记录霉菌生长情况。

内部霉菌特征：菌丝通常从粮粒的胚部、裂缝、基部等薄弱处萌发，呈“破壁而出”状。

记录菌落形态、颜色、生长速度。

分离纯化：

当霉菌菌丝长出并形成明显菌落时，用无菌接种针或灭菌的解剖针，挑取菌落边缘的少量菌丝。

转接到新的PDA平板上进行划线或点种。

重复此过程1-2次，直至获得纯培养物（即平板上只有一种形态的菌落）。

保存：

纯化后的菌株可接种到斜面培养基上，4°C短期保存。

长期保存可采用甘油管冷冻（-80°C）或冻干保藏。

四、 注意事项

无菌操作是生命线：全程在超净工作台内进行，所有工具、器皿、试剂必须无菌。

表面除菌要彻底但不过度：

消毒剂浓度和时间需预先优化，既要杀灭表面菌，又不能过度损伤粮粒或杀死内部菌。

漂洗务必充分，残留消毒剂会抑制霉菌生长。

验证除菌效果：

阴性对照：将经过除菌和漂洗的粮粒放入无菌水中振荡，取水样倾注平板，培养后应无菌生长。

阳性对照：取部分未除菌的粮粒，用同样方法培养，应有大量菌落（包括表面和内部菌）。

培养时间要充足：霉菌生长缓慢，切勿过早判为阴性。需培养5-7天以上。

避免污染：培养时平板倒置，防止冷凝水滴落。定期检查是否有杂菌污染。

安全防护：

操作霉菌时佩戴口罩，避免吸入孢子。

实验后对培养物、粮粒残渣进行高压灭菌处理。

对于已知产毒菌（如黄曲霉、寄生曲霉），应在生物安全柜内操作。

记录详细：记录每粒粮的来源、处理条件、生长菌的形态特征、分离日期等。

五、 常见内部霉菌举例

曲霉属 (Aspergillus)：如黄曲霉 (A. flavus)、寄生曲霉 (A. parasiticus) — 产黄曲霉毒素。

青霉属 (Penicillium)：如岛青霉 (P. islandicum)、桔青霉 (P. citrinum) — 产岛青霉毒素、橘霉素。

镰刀菌属 (Fusarium)：如禾谷镰刀菌 (F. graminearum)、三线镰刀菌 (F. tricinctum) — 产脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）。

毛霉属 (Mucor)、根霉属 (Rhizopus)：常见于高水分粮，导致“毛霉病”。

六、 总结

粮粒内部霉菌的分离是一项技术要求较高的微生物学操作，其核心在于通过表面除菌消除干扰，利用培养法“唤醒”并分离出潜伏在粮粒内部的霉菌。