食品检验员（在饲料领域常称为饲料检验员或质量控制员）进行可疑饲料霉菌的分离，是其在评估饲料卫生质量、排查霉变原因、鉴定产毒菌种以及保障动物健康与食品安全中的核心技能。饲料（尤其是谷物类、粕类原料）极易在收获、储存和加工过程中受霉菌污染，产生霉菌毒素（如黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等），对动物和人类健康构成严重威胁。因此，准确分离和鉴定可疑霉菌至关重要。

一、 目的与意义

确认霉变：明确饲料是否已发生霉菌污染，而非仅仅是结块或变色。

鉴定菌种：确定污染的具体霉菌种类，判断其是否为产毒菌株（如黄曲霉、寄生曲霉、镰刀菌等）。

溯源分析：追溯污染源头（如原料、储存环境、加工设备）。

风险评估：为后续的霉菌毒素检测提供靶向依据，评估饲料的安全性。

质量控制：为饲料生产和储存环节的改进提供科学依据。

二、 基本原理

利用选择性或非选择性培养基，在适宜的温度和湿度条件下，使饲料样品中的霉菌孢子萌发、菌丝生长，形成肉眼可见的菌落。通过观察菌落的形态、颜色、质地等特征，并结合显微镜检查，进行初步鉴定，必要时进行纯化培养和分子生物学鉴定。

三、 标准操作流程

1. 样品采集与准备

采样：遵循 GB/T 14699.1《饲料 采样》 标准，采用分层、多点随机采样法，确保样品代表性。采集可疑霉变区域及邻近区域样品。

处理：

将样品充分混匀。

对于颗粒料，可用无菌研钵或粉碎机轻度破碎，增大暴露面积，但避免过度粉碎产生热量杀死霉菌。

记录样品性状（颜色、气味、结块程度）。

2. 表面消毒（可选，视目的而定）

目的：若需分离内部侵染的霉菌（而非表面污染），需进行表面除菌。

方法：参照“粮粒内部霉菌分离”中的次氯酸钠法（1-2%，1-3分钟），充分漂洗干燥。

注意：若仅需了解整体霉菌污染状况（常规检测），通常不做表面消毒，直接进行稀释涂布或倾注。

3. 样品稀释（适用于定量或高污染样品）

目的：降低样品中微生物浓度，便于获得可计数的单菌落。

操作：

称取 10g 样品，加入装有 90mL 无菌生理盐水或0.1%无菌吐温-80溶液 的三角瓶中（含玻璃珠有助于分散）。

振荡或摇匀 20-30分钟，制成 10⁻¹ 稀释液。

用无菌移液器吸取 1mL 10⁻¹ 液，加入 9mL 无菌稀释液 中，制成 10⁻² 稀释液。

依此类推，制备 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴ 等系列稀释液。

4. 接种与培养

方法一：倾注平板法（推荐用于计数和分离）

取 1mL 适当稀释度的样品液（如10⁻², 10⁻³），加入无菌培养皿中。

倒入约 15-20mL 已融化并冷却至约 45°C 的培养基，轻轻旋转混匀。

凝固后，倒置培养。

方法二：涂布法

取 0.1mL 稀释液，滴加到已凝固的培养基平板表面。

用无菌涂布棒均匀涂布。

倒置培养。

方法三：直接点种法（适用于低污染或定性）

用无菌镊子夹取少量破碎的饲料颗粒，直接放置在培养基表面。

轻轻按压，使其与琼脂接触。

倒置培养。

常用培养基：

马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)：最常用，支持绝大多数霉菌生长。可添加氯霉素（50-100 mg/L） 抑制细菌生长。

孟加拉红培养基 (Rose Bengal Agar)：抑制菌丝蔓延，使菌落小而密集，便于计数。也常加氯霉素。

高盐察氏培养基 (Czapek Dox Agar with high salt)：选择性分离耐高渗霉菌（如曲霉、青霉）。

DRBC培养基 ( Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar)：商品化选择性培养基，抑制细菌和快速生长霉菌，利于计数。

培养条件：

温度：25-28°C（适合大多数霉菌）。

时间：5-7天，甚至更长（如10天）。霉菌生长慢，需耐心。

光照：采用 12小时光照/12小时黑暗 的光暗循环，有利于产孢和形态观察。

5. 观察、计数与初步鉴定

观察：

每日观察，记录菌落出现时间、数量、形态（绒毛状、絮状、粉末状）、颜色（正面和背面）、边缘特征。

计数（若为定量）：

培养5-7天后，选择菌落数在 10-150 之间的平板进行计数。

计算每克样品中霉菌菌落总数（CFU/g）。

初步鉴定：

根据菌落宏观特征，初步判断属（如曲霉、青霉、毛霉、根霉、镰刀菌）。

显微镜检查：挑取典型菌落，用乳酸酚棉蓝染色，制片镜检，观察孢子结构（分生孢子头、分生孢子梗、孢子形态等）进行属或种的鉴定。

6. 纯化与保存

纯化：

用无菌接种针挑取目标菌落的边缘菌丝，在新的PDA平板上划线或点种。

重复1-2次，获得纯培养物。

保存：

纯化菌株接种到PDA斜面，4°C短期保存。

长期保存：甘油管冷冻（-80°C）或冻干。

四、 化学检验员注意事项

生物安全：

操作时佩戴口罩、手套、实验服，最好在生物安全柜内进行，防止吸入霉菌孢子。

实验后所有培养物、残渣必须高压灭菌（121°C, 30分钟）后才能丢弃。

对于疑似产毒菌（如黄曲霉），应按生物安全二级（BSL-2） 要求操作。

无菌操作：全程在超净台内进行，防止外来污染。

培养基选择：

PDA + 氯霉素是最通用的组合。

若怀疑特定菌，可选用选择性更强的培养基。

培养时间：切勿过早判读。某些霉菌（如某些镰刀菌）生长缓慢，需7-10天。

结果解读：

高数量的霉菌（>10⁵ CFU/g）通常表明贮存条件不良。

分离到产毒菌（如黄曲霉、寄生曲霉、禾谷镰刀菌）是重大风险信号，需立即进行霉菌毒素检测。

记录完整：详细记录样品信息、稀释度、培养基、培养条件、菌落特征、鉴定结果。

五、 常见可疑饲料霉菌

六、 总结

可疑饲料霉菌的分离是饲料质量安全控制的“火眼金睛”。其核心在于通过科学的培养方法，将潜伏在饲料中的霉菌“请出来”，并通过形态学观察进行初步识别，为后续的精准鉴定和毒素检测奠定基础。