大肠埃希氏菌（Escherichia coli，简称大肠杆菌）是食品检验中非常重要的微生物指标之一。某些血清型的大肠杆菌可以引起严重的食源性疾病，因此检测和控制食品中的大肠杆菌对于保障食品安全至关重要。以下是大肠埃希氏菌的检验方法及其详细步骤：

大肠埃希氏菌检验方法

1. 多管发酵法（Most Probable Number, MPN）

原理

多管发酵法是一种统计学方法，通过将样品稀释后接种到多个含有选择性培养基的试管中，并在特定条件下培养观察是否产气来估计大肠埃希氏菌的数量。

操作步骤

样品制备与稀释

取适量代表性样品（如25g），加入到含有225ml无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的均质袋中。

使用均质器将样品充分混匀，制成1:10的初始稀释液。

根据需要进一步稀释，准备三个连续稀释度（例如10^-1、10^-2、10^-3）。

接种与培养

从每个稀释度中分别吸取1ml液体，接种到三支乳糖胆盐发酵管（每组三个重复）中。

将所有接种后的发酵管置于36±1℃条件下培养24小时。

结果判断

观察各发酵管是否有气体产生（可以通过倒置小玻璃管内是否有气泡或颜色变化判断）。

根据阳性反应（产气）的发酵管数量查找MPN表，得出样品中大肠埃希氏菌的最可能数（MPN/g 或 MPN/mL）。

确认试验

EC肉汤培养：将产气发酵管中的培养物接种到EC肉汤（Eosin Methylene Blue Agar）中，在44.5±0.2℃下培养24小时。如果产气，则表明存在大肠埃希氏菌。

生化鉴定：通过IMViC试验（吲哚试验、甲基红试验、VP试验、枸橼酸盐利用试验）等生化方法进一步确认。

对于显示产气的发酵管，进行后续的确证实验，通常包括：

2. 平板计数法

原理

利用选择性培养基在平板上培养大肠埃希氏菌，并通过计数菌落形成单位（CFU）来确定其数量。

操作步骤

样品制备与稀释

同多管发酵法中的样品处理步骤。

接种与涂布

选取适当的稀释度，吸取0.1ml稀释液均匀涂布于麦康凯琼脂（MacConkey Agar）或伊红美蓝琼脂（Eosin Methylene Blue Agar, EMB agar）表面。

每个稀释度至少做两个平行实验。

培养

将平板倒置放入36±1℃恒温培养箱中培养18至24小时。

计数与报告

计算每个平板上的典型大肠埃希氏菌菌落数（通常是带有金属光泽的深紫色菌落），并按照公式计算原始样品中的大肠埃希氏菌数量：

菌落总数（CFU/g或CFU/mL）=（平均菌落数×稀释倍数）/接种体积菌落总数（CFU/g或CFU/mL）=（平均菌落数×稀释倍数）/接种体积

确认试验

对疑似菌落进行纯化培养，并通过生化试验（如氧化酶试验、IMViC试验等）以及分子生物学方法（如PCR）来确认是否为大肠埃希氏菌。

3. 快速检测方法

随着技术的发展，市场上也出现了许多基于酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析试纸条、实时荧光定量PCR等快速检测方法，这些方法可以在较短时间内提供初步筛查结果，但通常需要后续确认实验以确保准确性。

免疫层析试纸条法

原理：基于抗原抗体特异性结合反应，使用标记物显示结果。

操作步骤：

准备样品提取液。

将提取液滴加到试纸条上，等待规定时间。

观察试纸条上的显色线，根据说明书判断结果。

实时荧光定量PCR

原理：通过对特定DNA序列的扩增和检测，实现对目标菌株的快速鉴定。

操作步骤：

提取样品中的总DNA。

设计并合成针对大肠埃希氏菌特异性基因的引物和探针。

进行PCR扩增，并通过荧光信号监测扩增产物。

根据CT值（循环阈值）判断是否存在大肠埃希氏菌。

注意事项

无菌操作：在整个过程中要严格遵守无菌技术，防止外界微生物污染影响结果。

培养条件控制：确保培养温度和时间符合标准要求，不同的培养基和方法可能有不同的最佳条件。

记录详细信息：包括样品来源、处理方式、稀释度、培养条件等，以便后续分析和追踪。

法规遵循：所有的操作应符合国家相关食品安全标准和法律法规要求，确保检测结果合法有效。

通过上述方法，食品检验员可以有效地检测食品中的大肠埃希氏菌含量，从而评估其卫生状况并采取相应的措施来保障食品安全。正确的检验流程不仅有助于预防食源性疾病的发生，还能提高消费者的信任度。