测定果酒和黄酒中的致病菌是确保这些酒精饮品安全的重要环节。由于果酒和黄酒在发酵过程中可能会受到微生物污染，因此检测其中的致病菌对于保障消费者健康至关重要。以下是几种常用的测定方法及其操作步骤。

一、常见的致病菌

果酒和黄酒中可能存在的致病菌包括但不限于：

沙门氏菌（Salmonella spp.）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）

大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）

志贺氏菌（Shigella spp.）

二、常用检测方法

1. 传统培养基法

操作步骤：

样品准备：

取样：从果酒或黄酒中均匀取样，确保样品具有代表性。

稀释：根据样品类型和预期污染水平，使用无菌生理盐水或缓冲液对样品进行适当稀释（如10倍系列稀释）。

增菌培养：

沙门氏菌：使用缓冲蛋白胨水（BPW）或其他适合的增菌培养基，在36±1°C下培养18-24小时。

金黄色葡萄球菌：使用胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或脑心浸液肉汤（BHI），在36±1°C下培养24小时。

单核细胞增生李斯特菌：使用李斯特菌增菌肉汤（LB1/LB2），先在30°C下培养24小时，再转至35-37°C下继续培养24小时。

大肠杆菌O157:H7：使用改良EC肉汤（mEC），在44.5°C下培养24小时。

志贺氏菌：使用GN增菌液，在36±1°C下培养6-8小时。

分离与纯化：

选择性平板培养：将增菌后的培养物划线接种到相应的选择性培养基上。

沙门氏菌：XLD琼脂、HE琼脂等。

金黄色葡萄球菌：Baird-Parker琼脂。

单核细胞增生李斯特菌：PALCAM琼脂、Oxford琼脂。

大肠杆菌O157:H7：山梨醇麦康凯琼脂（SMAC）。

志贺氏菌：SS琼脂、EMB琼脂。

培养条件：按照各培养基的要求设定温度和时间，通常为36±1°C下培养24-48小时。

生化鉴定：

通过生化试验进一步确认分离出的菌落是否为目标致病菌。

沙门氏菌：靛基质试验、尿素酶试验、赖氨酸脱羧酶试验等。

金黄色葡萄球菌：凝固酶试验、甘露醇发酵试验等。

单核细胞增生李斯特菌：CAMP试验、动力试验、氧化酶试验等。

大肠杆菌O157:H7：血清学凝集试验、志贺毒素基因检测等。

志贺氏菌：动力试验、乳糖发酵试验等。

2. 分子生物学技术

聚合酶链式反应（PCR）

PCR是一种高灵敏度和特异性的分子生物学技术，适用于快速检测致病菌的存在。

操作步骤：

核酸提取：从样品或初步筛选的可疑菌落中提取DNA。

引物设计：针对特定致病菌的目标基因设计特异性引物。

PCR扩增：进行PCR反应，扩增目标片段。

结果分析：通过电泳或实时荧光定量PCR（qPCR）分析扩增产物，判断是否存在目标致病菌。

实时荧光定量PCR（qPCR）

qPCR提供了更高的灵敏度和定量能力，适用于复杂基质中痕量致病菌的检测。

操作步骤：

同PCR，但需使用荧光染料或探针标记扩增产物，并通过仪器实时监测荧光信号强度，定量分析目标致病菌的数量。

3. 免疫学技术

酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是一种基于抗原抗体特异性结合原理的快速筛查方法，适用于大批量样品的初步筛选。

操作步骤：

试剂准备：包括包被抗体、酶标抗体、底物显色剂等。

加样反应：在预包被有致病菌特异性抗体的微孔板中加入样品和标准品，孵育一段时间后洗板。

结合与显色：加入酶标二抗，再次孵育后洗板，然后加入底物显色。

结果读取：使用酶标仪在450nm波长下读取OD值，计算样品中致病菌浓度。

三、注意事项

无菌操作：整个实验过程中必须严格遵守无菌操作规程，避免外界污染。

质量控制：每次实验都应设置阳性对照、阴性对照以及空白对照，以验证实验的有效性和准确性。

安全防护：处理致病菌时需佩戴适当的个人防护装备，并在生物安全柜内操作。

结果报告：准确记录实验数据，按照相关标准进行结果判定和报告。

四、总结

测定果酒和黄酒中的致病菌是保障食品安全的关键步骤。通过传统培养基法、分子生物学技术（如PCR）、免疫学技术（如ELISA）等多种手段，可以有效检测果酒和黄酒中的致病菌。每种方法都有其特点和适用范围，食品检验员应根据实际情况选择最合适的方法，并严格按照操作规程执行，以确保检测结果的准确性和可靠性。此外，不断学习新的检测技术和方法也有助于提高工作效率和数据质量。