微生物检验常见问题问答
问、灭菌锅化学检验和生物检验是每次实验都需要做吗？还是定期检验一下灭菌锅的性能呢？
答：化学法是每次都要做的，生物法可以定期做，根据灭菌锅的使用频率，每周、每半月或每月做一次即可。
问：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上会不会生长细菌？
答：SDA不是选择性培养基，而是一种广谱的增菌培养基，pH范围5.4-5.8，某些细菌是可以在SDA上生长的，霉菌和酵母菌总数计数时SDA上生长的菌均应计入霉菌和酵母菌总数；或者可以经过评估选择含有抗生素（如氯霉素）的SDA或者玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数计数。
问：琼脂培养基为什么需要倒置培养？
答：在进行微生物培养时，若正置培养，琼脂培养基中的水分易蒸发使平板干裂，不利于微生物的生长；同时水蒸汽会在平皿盖上形成冷凝水，若回落在培养基表面，会使菌落蔓延生长，无法计数，若冷凝水太多会使培养基与平皿分离，容易滑动倒置培养可减少培养基表面的空气流动，减慢培养基中水分蒸发的速度，充分维持弹性，有利于菌株的生长和繁殖，防止空气中杂菌对培养基及培养物造成污染；也会由于重力作用在一定程度上使营养物质沉积到培养基表面，有利于微生物利用营养物质；倒置的平板方便拿取，避免环境中杂菌的污染。
需要注意的是，《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB4789.15-2016）是要求正置培养，而非倒置，以防霉菌孢子形成次生菌落，影响计数结果。
问：食品企业的环境检测应该依据那个标准？
答：GB/T16294-2010《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》都有规定，可以做为参考。
问：请问高压灭菌锅需要操作人员有压力容器操作证吗?有些人说属于《特种设备安全监察条例》需要操作证？
答：CNAS-CL 01-A001: 2018的 6.2.2.2条款里有说讲到，如实验室使用的高压蒸汽灭菌器不属于简单压力容器(定义参见TSG R0003 -2007《简单压力容器安全技术监察规程》)时，操作人员需持有特种作业人员证。
问：
答：开瓶后的培养基，如果长时间不使用，还在效期内，建议开瓶后间隔1年进行复验。如果出现结块，则不能使用。同理，如果同一批次一次购买量较多，一年内未使用完，也建议进行复检。
问：控制菌检查法中用到的培养基，在做培养基适用性的时候，其中有“指示特性”的表述，那么“指示特性”是指的什么意思？
答：培养基指示特性包括菌落大小、形态特征、指示剂反应情况（菌落颜色变化）等。例如大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基上桃红色菌落有沉淀环、乙型副伤寒沙门菌在XLD有黑心等。
问：什么是不可接受微生物？
答：不可接受微生物通常是指那些已知有明显致病性的，存在足够的数量，通过产品的给药途径可能导致患者不可接受风险的微生物。如何确定一种微生物是不可接受的，需要进行风险分析，包括微生物负载量、微生物特性、产品特性、给药途径、对患者潜在影响等。
问： 培养基灭菌没有按照厂家提供的灭菌参数进行，是否可行？
答：可以。厂家产品说明书提供的灭菌参数可作为参考使用，使用单位也可以根据自己实验室的实际情况，在相关法规要求内，使用自己验证过的灭菌参数来执行。
【法规来源：中国药典2020版9203药品微生物实验室质量管理指导原则 ……培养基灭菌应按照生产商提供或使用者验证的参数进行……】
问：革兰氏染色有哪些注意事项？
答：（1）最好挑选18-24h的菌落进行革兰氏染色,培养时间过久的的革兰氏阳性细菌可能会被染成红色而造成假阴性。
（2）挑取适量的菌，不宜过多,均匀涂开。
（3乙醇脱色是革兰氏染色是否成功的关键,15-30s为宜，脱色不够可能会造成假阳性,脱色过度可能会造成假阴性。
问：如何根据实验需要制备斜面？
答：根据实验需求，摆放斜面一般有三种形式：
（1）长斜面：斜面底部刚覆盖试管底部，上部距管口2.5-3cm左右；例如TSA传代斜面。
（2）高层斜面：斜面与底层高度约为2:3，即底部高约3cm，斜面长度约2cm；如三糖铁高层斜面。
（3）普通斜面：斜面底部距试管底部约1cm，上部距管口约2.5-3cm。
问：三糖铁培养基颜色变化原理是什么？
答：该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，分解葡萄糖产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如菌种接至培养基培养后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
问：如果三糖铁上斜面红色、底层黄色，中间有黑色且产气，能否判定为沙门菌？
答：不能。某些非沙门菌也能在三糖铁上呈现和沙门菌一样的颜色变化，例如奇异变形杆菌。如三糖铁上有上述颜色变化，需要进一步的进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。
如果采用传统的生化鉴定，可参考GB 4789.4-2016中沙门氏菌检验的方法。
一
- 问答 -
GB 4789系列什么情况下应作阳性对照，假如检测50批样品致病菌都是阴性结果，需要人工污染样品做阳性对照来做质控吗？
答：GB 4789.1里规定要定期进行，没有明确说什么时候进行。自己实验室需要制定sop进行规定，比如我们实验室总是检出某个致病菌的阳性结果，就规定一个月的时间来进行阳性对照。保证实验室人员具有可以持续进行阳性检出的能力的。最新的RB/T 038-2020 食品微生物检测结果质量监控指南文件里规定：对于日常质量监控,应执行检测方法的规定，否则建议每批或每组样品每20个样品1次的频次进行；质控不一定需要人工污染样品来做，可以用标准菌株来做阳性和阴性对照。
二
- 问答 -
商品化的即用培养基（比如血平板平皿），有供应方的验收报告和CMA报告，购入后实验室是否还需要做验收吗？商品化基础培养基中需要添加的配套添加剂是否需要进行验收吗？如何验收呢？
答：目前的标准需要做，配套添加剂不需要单独验收。
三
- 问答 -
关于培养基性能测试，我们公司也有文件要求，我们平时做培养基性能测试除了参考GB4789.28外，可不可以也参考我们的文件做验收？
GB4789.28是一个最低的标准，一定要达到。比如EC肉汤只写了大肠埃希氏菌和粪肠球菌这两的菌株，必须要达到，如果企业自己的验收标准（里包含了国家标准里的菌株）高于国家标准，那就更好。
四
- 问答 -
在琼脂培养基制备过程中，发现灭菌后的培养基制成的平板部分偏软甚至有不凝固的现象，是什么原因？
答：主要是琼脂分布不均导致的。建议琼脂类培养基灭菌前加热溶解均匀（如果是大体积配制进行分装灭菌的培养基，建议煮沸溶解，搅拌分装）；灭菌后，使用前，关注培养基的透光性是否均一，如果不均一，轻轻摇晃使其均匀，再倾注平皿使用。
五
- 问答 -
平板在培养箱中培养后，平板干裂，缩水是什么原因？如何避免？
平皿干裂缩水，与琼脂的保水性、倾注培养基的量、平皿的透气性、培养箱条件等因素均有关系。
a.琼脂：不同的琼脂在保水性方面略有差异，保水性差的琼脂可能会出现严重缩水或者干裂。
b.培养基的量：倾注的培养基越少，平板越薄越容易干裂。按照GB4789要求，倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3 mm（直径90 mm的平皿，通常要加入18 mL～20 mL琼脂培养基）。如果平板需储存，或者培养时间超过48 h或培养温度高于40 ℃，则需要倾注更多的培养基。
c.平皿的透气性：平板的密封性越好，保存和培养过程中培养基失水越少。虽然增加平板的密封性可以减少水份流失，但并非密封性越高越好，一些需氧型微生物（如铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等），在密闭环境中生长较差，需要良好的透气性才能较好的生长。
d. 培养条件：培养箱是影响平皿干裂问题的关键因素之一。大型的培养箱为了保证内部温度均一，通常带有较强的鼓风系统，内部有较强的空气流动。而气流越强，则越容易导致平皿失水。而对于一些没有鼓风系统的小型培养箱，则很少会出现平皿干裂现象。在培养箱内摆放平皿时，应尽量避开风口气流大的位置，同时远离培养箱内部发热板。
综上所述，在遇到平板干裂缩水问题时，可通过增加平板培养基厚度、培养箱内增加挡板降低气流或避开风口、选择合适透气性的平皿、选择适宜琼脂的的培养基等进行综合的考虑分析，制定对应的方案和措施。
六
- 问答 -
灭菌后的琼脂培养基若未用完，可以下次再重新融化继续使用吗？
答：《GB4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出，含有活性化学物质或不稳定性成分的固体培养基也应即配即用，不可二次融化；因此对于一些已添加抗生素、卵黄、血清等不稳定成分的培养基，不可以再次融化使用。而对于一般的培养基（未开封启用），可使用沸水浴或采用有相同效果的方法使培养基融化，再次融化后未用完的培养基则不能重新凝固留待下次使用。
七
- 问答 -
标准菌株存活性怎么进行？
答：标准菌株存活性就是其的复活过程，我们购买的标准菌株一般是冻干粉或者冻干管，然后我们要对其进行复活培养，这个过程是必须的，否则我们没有办法使用。针对其存活性的验证，所有的标准法规中都是其存活性的判断，一个定性的判断。复活的过程对其进行打管，按照标准要求进行培养，如果接种到液体培养，有肉眼可见的浑浊或者进一步镜检时有目标微生物生长；如果接种到固体培养上，有肉眼可见的菌落，这些都叫存活性合格。
八
- 问答 -
实验室多久做一次沉降菌检测，哪个标准有规定？
答：每两周要做一次沉降菌检测包括操作台和房间的，方法可以参照GB/T 16294-2010，GB/T 27405-2008《实验室质量控制规范食品微生物检测 食品微生物检测》附录中有规定。
九
- 问答 -
实验室紫外灯怎么清洁？使用多久需要换新的紫外灯？还是说只要能用就不需要更换？
答：紫外线杀菌灯可以用纱布沾上75%酒精擦拭表面。紫外灯都有使用寿命，对于洁净室、生物安全柜等最好能够记录紫外灯的使用时间，到时间后必须更换。再就是根据定期的沉降菌监测情况更换紫外灯。
十
- 问答 -
灭菌后的琼脂培养基，是否可以在恒温箱或者恒温水浴锅过夜或更长时间存放？对培养基性能会有影响吗？
答：《GB4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出，融化后的培养基放入47～50℃的恒温水浴锅中冷却保温(可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴锅温度)，直至使用，培养基达到47℃～50℃的时间与培养基的品种、体积、数量有关。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4 h。
长时间的保温可能会造成培养基的营养成分流失，灵敏度下降，培养效果变差，琼脂的凝胶强度降低等情况，保温过夜或更长时间这种操作方法不是很规范。一般建议在满足试验安排的情况下，恒温存放的时间越短越好。
答：化学法是每次都要做的，生物法可以定期做，根据灭菌锅的使用频率，每周、每半月或每月做一次即可。
问：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上会不会生长细菌？
答：SDA不是选择性培养基，而是一种广谱的增菌培养基，pH范围5.4-5.8，某些细菌是可以在SDA上生长的，霉菌和酵母菌总数计数时SDA上生长的菌均应计入霉菌和酵母菌总数；或者可以经过评估选择含有抗生素（如氯霉素）的SDA或者玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数计数。
问：琼脂培养基为什么需要倒置培养？
答：在进行微生物培养时，若正置培养，琼脂培养基中的水分易蒸发使平板干裂，不利于微生物的生长；同时水蒸汽会在平皿盖上形成冷凝水，若回落在培养基表面，会使菌落蔓延生长，无法计数，若冷凝水太多会使培养基与平皿分离，容易滑动倒置培养可减少培养基表面的空气流动，减慢培养基中水分蒸发的速度，充分维持弹性，有利于菌株的生长和繁殖，防止空气中杂菌对培养基及培养物造成污染；也会由于重力作用在一定程度上使营养物质沉积到培养基表面，有利于微生物利用营养物质；倒置的平板方便拿取，避免环境中杂菌的污染。
需要注意的是，《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB4789.15-2016）是要求正置培养，而非倒置，以防霉菌孢子形成次生菌落，影响计数结果。
问：食品企业的环境检测应该依据那个标准？
答：GB/T16294-2010《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》都有规定，可以做为参考。
问：请问高压灭菌锅需要操作人员有压力容器操作证吗?有些人说属于《特种设备安全监察条例》需要操作证？
答：CNAS-CL 01-A001: 2018的 6.2.2.2条款里有说讲到，如实验室使用的高压蒸汽灭菌器不属于简单压力容器(定义参见TSG R0003 -2007《简单压力容器安全技术监察规程》)时，操作人员需持有特种作业人员证。
问：
答：开瓶后的培养基，如果长时间不使用，还在效期内，建议开瓶后间隔1年进行复验。如果出现结块，则不能使用。同理，如果同一批次一次购买量较多，一年内未使用完，也建议进行复检。
问：控制菌检查法中用到的培养基，在做培养基适用性的时候，其中有“指示特性”的表述，那么“指示特性”是指的什么意思？
答：培养基指示特性包括菌落大小、形态特征、指示剂反应情况（菌落颜色变化）等。例如大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基上桃红色菌落有沉淀环、乙型副伤寒沙门菌在XLD有黑心等。
问：什么是不可接受微生物？
答：不可接受微生物通常是指那些已知有明显致病性的，存在足够的数量，通过产品的给药途径可能导致患者不可接受风险的微生物。如何确定一种微生物是不可接受的，需要进行风险分析，包括微生物负载量、微生物特性、产品特性、给药途径、对患者潜在影响等。
问： 培养基灭菌没有按照厂家提供的灭菌参数进行，是否可行？
答：可以。厂家产品说明书提供的灭菌参数可作为参考使用，使用单位也可以根据自己实验室的实际情况，在相关法规要求内，使用自己验证过的灭菌参数来执行。
【法规来源：中国药典2020版9203药品微生物实验室质量管理指导原则 ……培养基灭菌应按照生产商提供或使用者验证的参数进行……】
问：革兰氏染色有哪些注意事项？
答：（1）最好挑选18-24h的菌落进行革兰氏染色,培养时间过久的的革兰氏阳性细菌可能会被染成红色而造成假阴性。
（2）挑取适量的菌，不宜过多,均匀涂开。
（3乙醇脱色是革兰氏染色是否成功的关键,15-30s为宜，脱色不够可能会造成假阳性,脱色过度可能会造成假阴性。
问：如何根据实验需要制备斜面？
答：根据实验需求，摆放斜面一般有三种形式：
（1）长斜面：斜面底部刚覆盖试管底部，上部距管口2.5-3cm左右；例如TSA传代斜面。
（2）高层斜面：斜面与底层高度约为2:3，即底部高约3cm，斜面长度约2cm；如三糖铁高层斜面。
（3）普通斜面：斜面底部距试管底部约1cm，上部距管口约2.5-3cm。
问：三糖铁培养基颜色变化原理是什么？
答：该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，分解葡萄糖产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如菌种接至培养基培养后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
问：如果三糖铁上斜面红色、底层黄色，中间有黑色且产气，能否判定为沙门菌？
答：不能。某些非沙门菌也能在三糖铁上呈现和沙门菌一样的颜色变化，例如奇异变形杆菌。如三糖铁上有上述颜色变化，需要进一步的进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。
如果采用传统的生化鉴定，可参考GB 4789.4-2016中沙门氏菌检验的方法。
一
- 问答 -
GB 4789系列什么情况下应作阳性对照，假如检测50批样品致病菌都是阴性结果，需要人工污染样品做阳性对照来做质控吗？
答：GB 4789.1里规定要定期进行，没有明确说什么时候进行。自己实验室需要制定sop进行规定，比如我们实验室总是检出某个致病菌的阳性结果，就规定一个月的时间来进行阳性对照。保证实验室人员具有可以持续进行阳性检出的能力的。最新的RB/T 038-2020 食品微生物检测结果质量监控指南文件里规定：对于日常质量监控,应执行检测方法的规定，否则建议每批或每组样品每20个样品1次的频次进行；质控不一定需要人工污染样品来做，可以用标准菌株来做阳性和阴性对照。
二
- 问答 -
商品化的即用培养基（比如血平板平皿），有供应方的验收报告和CMA报告，购入后实验室是否还需要做验收吗？商品化基础培养基中需要添加的配套添加剂是否需要进行验收吗？如何验收呢？
答：目前的标准需要做，配套添加剂不需要单独验收。
三
- 问答 -
关于培养基性能测试，我们公司也有文件要求，我们平时做培养基性能测试除了参考GB4789.28外，可不可以也参考我们的文件做验收？
GB4789.28是一个最低的标准，一定要达到。比如EC肉汤只写了大肠埃希氏菌和粪肠球菌这两的菌株，必须要达到，如果企业自己的验收标准（里包含了国家标准里的菌株）高于国家标准，那就更好。
四
- 问答 -
在琼脂培养基制备过程中，发现灭菌后的培养基制成的平板部分偏软甚至有不凝固的现象，是什么原因？
答：主要是琼脂分布不均导致的。建议琼脂类培养基灭菌前加热溶解均匀（如果是大体积配制进行分装灭菌的培养基，建议煮沸溶解，搅拌分装）；灭菌后，使用前，关注培养基的透光性是否均一，如果不均一，轻轻摇晃使其均匀，再倾注平皿使用。
五
- 问答 -
平板在培养箱中培养后，平板干裂，缩水是什么原因？如何避免？
平皿干裂缩水，与琼脂的保水性、倾注培养基的量、平皿的透气性、培养箱条件等因素均有关系。
a.琼脂：不同的琼脂在保水性方面略有差异，保水性差的琼脂可能会出现严重缩水或者干裂。
b.培养基的量：倾注的培养基越少，平板越薄越容易干裂。按照GB4789要求，倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3 mm（直径90 mm的平皿，通常要加入18 mL～20 mL琼脂培养基）。如果平板需储存，或者培养时间超过48 h或培养温度高于40 ℃，则需要倾注更多的培养基。
c.平皿的透气性：平板的密封性越好，保存和培养过程中培养基失水越少。虽然增加平板的密封性可以减少水份流失，但并非密封性越高越好，一些需氧型微生物（如铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等），在密闭环境中生长较差，需要良好的透气性才能较好的生长。
d. 培养条件：培养箱是影响平皿干裂问题的关键因素之一。大型的培养箱为了保证内部温度均一，通常带有较强的鼓风系统，内部有较强的空气流动。而气流越强，则越容易导致平皿失水。而对于一些没有鼓风系统的小型培养箱，则很少会出现平皿干裂现象。在培养箱内摆放平皿时，应尽量避开风口气流大的位置，同时远离培养箱内部发热板。
综上所述，在遇到平板干裂缩水问题时，可通过增加平板培养基厚度、培养箱内增加挡板降低气流或避开风口、选择合适透气性的平皿、选择适宜琼脂的的培养基等进行综合的考虑分析，制定对应的方案和措施。
六
- 问答 -
灭菌后的琼脂培养基若未用完，可以下次再重新融化继续使用吗？
答：《GB4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出，含有活性化学物质或不稳定性成分的固体培养基也应即配即用，不可二次融化；因此对于一些已添加抗生素、卵黄、血清等不稳定成分的培养基，不可以再次融化使用。而对于一般的培养基（未开封启用），可使用沸水浴或采用有相同效果的方法使培养基融化，再次融化后未用完的培养基则不能重新凝固留待下次使用。
七
- 问答 -
标准菌株存活性怎么进行？
答：标准菌株存活性就是其的复活过程，我们购买的标准菌株一般是冻干粉或者冻干管，然后我们要对其进行复活培养，这个过程是必须的，否则我们没有办法使用。针对其存活性的验证，所有的标准法规中都是其存活性的判断，一个定性的判断。复活的过程对其进行打管，按照标准要求进行培养，如果接种到液体培养，有肉眼可见的浑浊或者进一步镜检时有目标微生物生长；如果接种到固体培养上，有肉眼可见的菌落，这些都叫存活性合格。
八
- 问答 -
实验室多久做一次沉降菌检测，哪个标准有规定？
答：每两周要做一次沉降菌检测包括操作台和房间的，方法可以参照GB/T 16294-2010，GB/T 27405-2008《实验室质量控制规范食品微生物检测 食品微生物检测》附录中有规定。
九
- 问答 -
实验室紫外灯怎么清洁？使用多久需要换新的紫外灯？还是说只要能用就不需要更换？
答：紫外线杀菌灯可以用纱布沾上75%酒精擦拭表面。紫外灯都有使用寿命，对于洁净室、生物安全柜等最好能够记录紫外灯的使用时间，到时间后必须更换。再就是根据定期的沉降菌监测情况更换紫外灯。
十
- 问答 -
灭菌后的琼脂培养基，是否可以在恒温箱或者恒温水浴锅过夜或更长时间存放？对培养基性能会有影响吗？
答：《GB4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出，融化后的培养基放入47～50℃的恒温水浴锅中冷却保温(可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴锅温度)，直至使用，培养基达到47℃～50℃的时间与培养基的品种、体积、数量有关。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4 h。
长时间的保温可能会造成培养基的营养成分流失，灵敏度下降，培养效果变差，琼脂的凝胶强度降低等情况，保温过夜或更长时间这种操作方法不是很规范。一般建议在满足试验安排的情况下，恒温存放的时间越短越好。
