一、显微镜检验技术：主要介绍普通光学显微镜的微生物镜检技术。

1、测微与计数

1）、测微：测微是指用测微尺来测量微生物的大小。测量微生物个体大小是微生物分类鉴定中一项重要工作。测微尺包括两种：接目测微尺和接物测微尺。

①测微尺的构造：接目测微尺简称目尺，是一圆形玻片，玻片中央有一刻度尺，即将5mm的长度等分成50个小格，每小格等于0.1mm即100µm，使用时装人目镜的光栅处。

接物测微尺简称物尺，是放在载物台上的一块碎片。在它的中央有一条长1mm被分成100个小格的等分线，每小格长0.01mm即10µm。

②测微尺的使用：

a、目尺显微长度的标定：因目尺是安装在目镜中，所测得的物像均已被物镜放大，因此在使用放大倍数不同的物镜时，目尺的显微长度（即目尺每小格代表经过显微放大的实际长度）是不一致的。所以在不同放大倍数的镜头系统下，必须分别用物尺进行标定目尺每格的显微长度。目尺显微长度标定具体方法如下：先将目尺装入目镜没内，刻度向下，并将物尺放在载物台上，使刻度朝上。按镜检的方法和步骤，在镜下找到物尺的刻度，再转动目镜，使两尺刻度平行，并使两尺的第一条刻度线重合，向右寻找另外相重合的刻度线。记录两个重叠刻度间目尺和物尺的格数，根据下列公式计算目尺的显微长度：h=m×10／N  式中：h——目尺的显微长度     m——代表两个重合线间物尺的格数     N——代表两个重合线间目尺的格数

b、微生物菌体大小的测量在目尺的显微长度确定以后，便可取下物尺，放置欲测定其大小的微生物玻片标本，进行测微。首先，在视野中选取一个单独得菌体，以横和纵的方向来测量，视其相当目尺刻度多少格，再乘以显微长度，即可算出菌体的大小。如是球菌只测量其直径；若是杆菌则要测量出菌体的长和宽。例如某一杆菌，测量出长2个小格，宽为0.5小格，显微长度为2.0µm，则该杆菌的大小为4.0µm（2×2.0µm）~1.0µm（0.5×2.0µm）。

二、细菌的镜检

细菌的镜检的项目有细菌的形态、大小、革兰氏染色反应，有无芽孢、荚膜、鞭毛以及细胞运动情况等。

1、细菌的制片方法：在镜检前必须将被检物制成玻片标本，才能观察，用于标本的玻片应非常干净。

根据被检物所要检查的项目和供检材料的不同，其制片方法有以下三种：

涂片法：涂片法适用于细菌结构的观察，其方法是：首先在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水，用灭菌的接种环取少许菌体，放在载玻片上，与水混合涂成直径约为1cm的均匀薄片，即成涂片。用这种涂片法制的标本在显微镜下一般不直接看，经染色后才能看得清晰。

普通法（压片法）：用普通法制作活细菌标本，不但便于观察细菌的运动，而且还能观察细菌的形状、大小和芽孢。其方法是：在干净的载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环挑取一环供检材料放入水中并混匀，若供检材料为液体而不太浓时，则不必加水。然后加放盖玻片，在盖片时，应先把盖片的一端放在载玻片上，再慢慢向下压盖，勿使水从该玻片边缘溢出。同时避免发生气泡，然后用干净的玻璃棒等使盖片紧贴在载玻片上。为了便于观察，可用美蓝或复红等染色液代替谁使用，将细菌染成蓝色或红色，然后把盖玻片盖上，在进行镜检，这样看的较为清晰。

悬滴法：悬滴法用于观察生活状态的细菌，如细菌的运动、繁殖方式、孢子萌发等。其方法是：取一滴蒸馏水或培养液于干净的盖玻片中央，再取一环培养好的菌体，接种于盖玻片的液滴中，然后将盖玻片翻转过来，盖于凹玻片的凹窝中，使菌液正好倒垂在载玻片的凹窝中央，不要使水滴碰到凹窝的壁和底。为防止干燥，在盖玻片边沿上涂上凡士林，使菌液紧紧处在密闭的小室中，即可镜检。因为没有染色的活细菌是透明的，不易看到，必须降低聚光器或缩小光圈，以减少照明强度，认真观察，才能得到良好效果，若观察其繁殖或孢子萌发时，需将带有悬滴的玻片放在底部铺有湿纸或湿棉的培养皿中，以便保湿，盖好皿盖进行定温培养，而后镜检。

2、细菌芽孢、荚膜、鞭毛染色法：细菌芽孢染色法：芽孢染色法是利用细菌和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别，芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢。进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再用复染液（如番红液）或衬托液（如黑色素）处理，则菌体和芽孢易于区分。其操作过程如下：

①将培养24h左右的芽孢杆菌作涂片、干燥、固定。②滴加3~5滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上。③用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽，但勿沸腾。切忌时染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽开始约4~5min。④倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。⑤用番红水溶液复染1min，水洗。⑥待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌呈红色。

3、细菌的染色方法：由于细菌个体透明，在光学显微镜下不易观察到其形态，必须借助于染色的方法使菌体着色，增加与背景的明暗对比，才能在光学显微镜下较为清楚地观察其个体形态和部分结构。按照所用染料种类的不同，可将染色法分成两大类：单染色法和复染色法。

单染色法又称普通染色法，只用一种染料染色，适用于菌体一般形态观察。操作过程为：按涂片法制成的涂片，进行固定，固定方法有自然干燥或加温干燥。通常采用加温固定，可在酒精灯火焰上快速来回烘烤涂片背面，以手摸载片发烫时为宜。在固定好的玻片上加染色液1~2滴（吕氏美蓝或碱性复红液），使其盖满玻片，静止1~2min。用细小水流慢慢冲去染料，再用吸水纸吸去玻片上的水分，待晾干后即可镜检。

复染色法（革兰氏染色法）又称鉴别染色法，是用两种或多种染料进行染色，有帮助鉴别细菌之用。最常用的为革兰氏染色法。染色结果，菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G⁺），红色者为革兰氏阴性菌（G^-）

其操作步骤如下：①涂片固定：取培养24~48h的细菌按单染色法涂片固定。②初染：滴加结晶紫液，全部覆盖于涂片上，染色1min后，用细水流冲洗，而后用吸水纸轻轻吸干。③媒染：加路氏碘液，1min后水洗，同样用吸水纸吸干。路氏碘液是一种媒染剂，具有助染作用。④脱色：加95%（体积分数）酒精经10~30秒后，水洗，同样用吸水纸吸干。⑤复染：加石炭酸复红液染0.5min后，水洗，吸干。即可在油镜下镜检。

在进行革兰氏染色过程中，以涂片和酒精脱色这两步最为关键。涂片切不可过于浓厚，要求薄而均匀。过于密集的细菌涂片常常影响脱色结果，而呈现假阳性反应。95%（体积分数）酒精，这种脱色剂，脱色能力很强，所以要求脱色时应恰当掌握。脱色过轻，阴性菌脱色不掉紫色会造成假阳性；若脱色过重，阳性菌的紫色也会被脱掉而造成假阴性。

此外，革兰氏染色的结果还与菌龄有关。一般幼龄菌的革兰氏染色反应比较正常，老龄菌的革兰氏染色反应常有变化，特别是革兰氏阳性菌，在老龄时常是阴性反应。因此，革兰氏染色所用的菌种一般是24~48h的培养物。

第二节   食品微生物检验样品的采取和处理

一、食品微生物检验样品的采集

在食品的检验中，样品的采集是极为重要的一个步骤。所采集的样品必须具有代表性。

1、食品微生物检验的取样方案

采用什么样的取样方案主要取决于检验的目的。检验的目的可以是用食品卫生学微生物检验去判定一批食品合格与否，也可以是查找食物中毒病原微生物，还可以是鉴定畜禽产品中是否含有人畜共患病原体等。目的不同，取样方案也不同。下表是我国的食品样品取样方案：

各 种 样 品 采 集 数 量

2、食品微生物检验的取样方法

按照上述采样方案，能采取最小包装的食品就采取完整包装，必须拆包装取样的应按无菌操作进行。不同类型的食品应采用不同的工具和方法：

①液体食品：充分混匀，用无菌操作开启包装，用100ml无菌注射器抽取，注入无菌盛样容器。

②半固体食品：用无菌操作开启包装，用无菌勺子从不同部位挖取样品，放入无菌盛样容器。

③固体样品：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取，割取时应兼顾表面与深部，注意样品的代表性，小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌盛样容器。

④冷冻食品：大包装小块冷冻食品按小块个体采取样品；大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冰块上锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎屑状样品，放入无菌盛样容器。

另外，还应注意检验目的。若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应取深层样品。

二、食品微生物检验样品的预处理方法

由于食品检样种类繁多，来源复杂，各类预检样品并不是拿来就能检验，要根据食品种类的不同性状，经过预处理后，制备成稀释液才能进行有关的各项检验。

1、半固体或黏性液体食品：此类样品无法用吸管吸取，可用灭菌容器称取检样25g，加入预温至45℃的灭菌生理盐水或蒸馏水225ml中，摇荡溶化或使用恒温振荡器溶化，溶化后尽快检验。从样品稀释到接种，一般不要超过15min。

2、固体食品：固体食品的处理相对较复杂，处理方法主要有以下几种：

①捣碎均质方法：将100g或100g以上的样品剪碎混匀，从中取25g放入带有225ml稀释液的无菌均质杯中，以8000~10000r/min的速度均质1min。这是对大部分食品样品都适用的方法。

②剪碎振摇法：将100g或100g以上的样品剪碎混匀，从中取25g进一步剪碎，放入带有225ml稀释液和适量φ=5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅不小于40cm。

③研磨法：将100g或100g以上的样品剪碎混匀，取25g放入无菌乳钵中充分研磨后再放入带有225ml无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。

④整粒振摇法：有完整自然保护膜的颗粒状样品（如蒜瓣、青豆等），可以直接称取25g整粒样品置入带有225ml无菌稀释液和适量玻璃珠的无菌稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅在40cm以上。

3、液体样品：液体样品指粘度不超过牛奶的非黏性食品，可直接用灭菌吸管准确吸取25ml样品加入225ml蒸馏水或生理盐水及有关检验的增菌液中，制成1：10的稀释液。吸取前要将样品充分混合，取样的吸管插入样品的深度一般不要超过25mm。除此之外，在开瓶、开罐等打开样品容器时，一定要注意表面消毒，无菌操作。用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开。含有CO₂的液体饮料先倒入灭菌的小瓶中，之后覆盖灭菌纱布，轻轻摇荡，待无气体后再进行检验。酸性食品用10%灭菌的NaCO₃调PH值中性后再进行检验

4、送检：样品处理好后，应尽快检验。