一、微生物的酶

酶是由活的微生物体产生的、具有特殊催化能力的蛋白质。它能在常温、常压下促进微生物体内一系列的分解代谢与合成代谢的各种反应。

二、微生物的能量代谢

微生物所需能量的来源和外界的能源物质如何变成微生物可利用的形式，以及如何被微生物利用等，都是微生物能量代谢的基本问题。

1、ATP的生成：ATP是腺嘌呤核苷三磷酸（腺三磷）的缩写，是生物体中最重要的高能磷酸化合物，通常以A—P～P—P表示。“A”为腺嘌呤，“P”为磷酸根，“～”代表高能键。

但ATP的生成过程需要供应能量，能量来自光能或者化学能，以光能生成ATP的过程称为光能磷酸化作用，以化学能生产ATP的过程称为氧化磷酸化作用。

微生物的氧化作用可根据最终电子受体的性质，分为有氧呼吸作用、无氧呼吸作用和发酵作用三种。

上述三种生物氧化的方式，获得能量的水平不同，如以葡萄糖作为氧化的底物时，它们放出能量的反应见下表：

不同氧化方式的放能反应

氧化过程中所释放出的大部分能量，只有通过磷酸化作用转移至ATP中，才能成为生物可利用的能量。

2、微生物的呼吸类型：根据微生物与分子态氧的关系，即微生物在生活中是否需要氧，可将微生物分为以下几个类型。

1）好氧性微生物：凡是生活中需要氧的微生物称为好氧性微生物或好气性微生物。大多数是细菌、所有的放线菌和霉菌都属于此类型。在自然界中，好氧性微生物的种类和数量都是最多的。

2）微好氧性微生物：只需要在微量氧的条件下生活的微生物称为微好氧性微生物，如固氮螺菌。

3）厌氧性微生物：凡生活中不需要氧的微生物称为厌氧性微生物。某些细菌，如某些梭状芽孢杆菌。

4）兼性厌氧性微生物：凡在有氧或无氧的条件下都能生活的微生物称为兼性厌氧性微生物。它们可在有氧或无氧的情况下以不同的氧化方式产生能量，有两种类型：

①在有氧的条件下进行有氧呼吸，在无氧的条件下进行无氧呼吸。如反硝化细菌，在有氧时，以氧作为最终电子受体进行有氧呼吸，在无氧时，以无机物NO₃^－中的氧作为电子受体进行无氧呼吸。

②在有氧的条件下进行有氧呼吸作用，在无氧的条件下进行发酵作用，如酵母菌，在有氧时进行有氧呼吸，产生CO₂和H₂O，基质被彻底氧化，释放较多能量，而在无氧条件下则进行发酵作用，产生CO₂和C₂H₅OH，即酒精发酵。

3、微生物的物质代谢及其产物

蛋白质的代谢：蛋白质是微生物的有机氮源。但大部分微生物不能利用纯粹的蛋白质，因为蛋白质不能透过细胞膜。必须由胞外酶把它分解成简单的产物，如Aa等，然后才能被微生物吸收而利用来构成菌体本身的成分。细菌分解蛋白质的能力如液化明胶和酪蛋白的胨化等，可用于鉴别细菌。此外，有些细菌在分解Aa时，还可以产生一些特殊的产物，根据这些产物可以用作细菌的鉴别。例如，大肠杆菌可以分解色氨酸产生吲哚。有些细菌如变形杆菌能分解胱氨酸等氨基酸而产生H₂S。通常在培养基中加入醋酸铅，H₂S遇醋酸铅，变成棕黄色或黑色的硫化铅。这种方法也常用来作微生物分解Aa的生理生化鉴定。

糖的代谢：糖的种类很多，多数糖能被微生物利用。而微生物能否利用某些糖类，主要决定于微生物所具有的酶系统的性质。糖在有充分氧的环境中，被微生物利用时一般可以彻底分解为CO₂和H₂O，而无中间产物的积累。糖在缺氧的条件下被微生物利用时，可形成多种不完全的代谢产物如C₂H₅OH、乳酸等。无论是在有氧或缺氧的条件下，微生物利用糖类所产生的代谢产物是多种多样的。因此，可根据不同微生物在一定条件下进行糖代谢过程中所具有的代谢产物的特点，来鉴别微生物。

脂类代谢：虽然微生物也能利用脂类，但从量上来看，脂类不是微生物的主要养料。有些细菌能分泌脂肪酶，可以把脂肪分解为甘油及脂肪酸。甘油的分解代谢按照糖的代谢方式进行。而脂肪酸则是通过β氧化作用进入三羧酸循环的过程进行分解，最终被分解为CO₂和H₂O

4、微生物的特殊代谢产物

①毒素：微生物在物质代谢过程中，能产生对人或动物有毒害的物质，称为毒素。微生物所产生的毒素可分为内毒素和外毒素两大类。

内毒素存在于细菌体内，不分泌到菌体外，只能在菌体裂解时，毒素才能被释放出来。

外毒素是由菌体内向菌体外分泌出来的一种有毒物质，毒力较强。

②抗菌素：有些微生物在代谢过程中可产生具有抑制或杀死它种微生物的物质，这种物质称为抗菌素，例如点青霉和产黄青霉产生青霉素。

第七节   微生物培养基的配制

一、原理

大多数微生物均可用人工方法培养。以人工方法配制成的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，称为培养基，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的ph值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

二、培养基的种类

培养基按物理状态分为固体、半固体和液体培养基；按组成成分分为天然、合成和半合成培养基；按其作用分为基础、加富、选择、鉴别、厌氧和活体培养基等。

1、基础培养基：含有微生物所需要的基本营养成分，如肉汤培养基。

2、加富培养基：在基础培养基中再加入葡萄糖。血液、血清或酵母浸膏等物质，可供营养要求较高的微生物生长，如血平板、血清肉汤等。

3、活体培养基：有一些微生物可以在活的动植物体或离体的活组织细胞内生长繁殖，因此，某些活的动植物体或离体的活组织细胞对这些微生物来说，是很好的培养基。

4、选择培养基：是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理。化学条件的抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以把所需要的微生物从混杂的其他微生物中分离出来。

5、鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后发生某种化学变化，从而鉴别不同类型的微生物。如伊红－美蓝（EMB）培养基、糖发酵管、醋酸铅培养基等。

6、厌氧培养基：专性厌氧菌不能在有氧的条件下生长，所以必须将培养基与环境中的空气隔绝，或降低培养基中的氧化还原电位，如在液体培养基的表面加盖凡士林或醋，或在液体培养基中加入碎肉快制成庖肉培养基等。此外，也可以利用物理或化学的方法除去培养环境中的氧，以保证厌氧环境。

三、培养基的制备

培养基的制备过程可表示为：

称量药品→溶解→调节PH值→溶化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。

1、称量药品;根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2、溶解：用量筒取一定量（约占总量的1/2）蒸馏水倒入盛有药品的烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他原料，待完全溶化后，补足水分。

3、调节PH值：根据培养基对PH值的要求，用50g/LNaOH或5%（体积分数）HCl溶液调至所需的PH值。测定PH值可用PH试纸或酸度计等。

4、溶化琼脂：固体或半固体培养基须加入一定量的琼脂，将盛有培养基的器皿置于电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全溶化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

5、过滤分装：先将过滤分装装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸；如果是固体或半固体培养基，则须在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在瓶口或管口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装量为管高的1/5，半固体分装量一般以试管高度的1/3为宜，分装三角瓶，以不超过三角瓶容积的一半为宜。

6、包扎标记：培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称、制备组别和实验者姓名、日期等。

7、灭菌：上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃，20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成分。如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面。斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。

四、培养基的主要成分

1、营养物质：有蛋白胨、肉浸汁和牛肉膏、糖（醇）类、血液、鸡蛋与动物血清、生长因子、无机盐类。

2、水分：制备培养基常用蒸馏水（因蒸馏水中不含杂质），也可用自来水、井水等，但需先经煮沸，使部分盐类沉淀，再经过滤方可使用。

3、凝固物质：配制固体培养基的凝固物质有琼脂、明胶和卵白蛋白及血清等。琼脂是从石花菜海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。其化学成分主要是多糖，加琼脂制成的培养基在98～100℃下溶化，于45℃以下凝固。但多次反复溶化，其凝固性降低。琼脂本身对细菌无营养价值，自然界中仅有极少数的细菌能分解它。

根据琼脂含量的多少，可配制成不同性状的培养基。另外，由于各种牌号琼脂的凝固能力不同，以及当时气温的不同，配制时用量应酌情增减，夏季可适当多加。

4、抑制剂：在制备某些培养基时需加入一定的抑制剂，来抑制非检出菌的生长或使其少生长，以利于检出菌的生长。抑制剂种类很多，常用的有胆盐、煌绿、玫瑰红酸、亚硫酸钠、某些染料及抗菌素等。这些物质具有选择性抗菌作用。

5、指示剂：为便于了解和观察细菌是否利用和分解糖类等物质，常在某些培养基中加入一定种类的指示剂，如酸碱指示剂、氧化还原指示剂等。

第八节   食品微生物的生长

一、微生物的生长曲线及其应用

微生物群体生长是指细胞数量的增加，是细胞生长和繁殖的结果。现以单细胞的分裂方式进行繁殖的细菌为对象考察其群体生长的规律。

将少量细菌接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的温度下进行培养时，它的生长具有一定的规律性。在其生长过程中，定时取样计算细菌细胞数量。然后以细菌细胞数的对数作纵坐标，以生长时间作横坐标，绘制所得的曲线叫生长曲线。生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖至衰老死亡过程的动态变化。我们根据细菌生长繁殖速率的不同，将细菌的生长曲线大致分为下列四个时期。

1、延迟期：当少量细菌接种到新鲜的液体培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速率等于零，这段时间称为延迟期。处于延迟期的细菌细胞分裂迟缓、代谢活跃，细胞体积增长较快，但对不良的环境因素如高温、低温和高浓度的盐溶液等比较敏感，容易死亡。

延迟期时间的长短，因细菌种类和培养条件从几分钟到几小时不等，若用生命活动旺盛的细菌接种，且接种量大，则延迟期时间短。

2、稳定期：在这一时期，活细胞数目达到最高峰，但它的总数不会在增加。这是因为必要的营养物质逐渐耗尽，同时某些有毒代谢产物在积累，以及其他外界因素都会使生长受到抑制，死亡率和繁殖率两者达到平衡，活菌数保持相对稳定，在曲线上保持平稳。如果为了大量获得菌体，就应在此阶段收获。这一时期也是发酵过程积累代谢产物的主要阶段。以上可以看出，稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也得到了最高峰。稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关，生产上常常通过补料、调节PH值、调整温度等措施来延长稳定期，以积累更多的代谢产物。

3、对数期：在此期间，代谢活动最强，组成新细胞物质最快，所有分裂形成的新细胞都生活旺盛。这一阶段细菌数以几何级数增加，所以称为对数期。由于处于对数期的微生物的个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速，所以是研究基本代谢的良好材料，也是发酵工业良好的种子。如果用作菌种，则延迟期很短，以至检查不出延迟期。可在短时间内获得大量微生物以缩短发酵周期。

4、衰亡期：稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡率大大超过新生菌，菌体中活菌数急剧下降，出现了“负生长”。此时期为衰亡期

二、测定微生物群体数目的方法

1、计算器测定法：用特制的细菌计数器或血球计算器进行计数。本方法很简便，可以立即得出结果，但也有一些局限性，主要表现在活细胞不易区分。

2、平板菌落计数法：取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，算出培养物中的活菌数，故此法又称为活菌测定法。

3、稀释法;将待测样品作一系列稀释，如10^－1、10^－2、10^－3等，取1ml接种到新鲜培养基中，然后根据生长的稀释度与出现生长的最高稀释度（即临界级数），再用“或然率”理论，就可计算出样品单位体积中细菌的近似值。

4、涂片染色法：将已知体积的待测微生物均匀的涂布在载波片的已知面积内，经固定染色后，在显微镜下借助目镜测微尺测得视野的半径和面积。得知其中视野菌的总数。然后从几个视野的平均细胞数计算每毫升原液菌的细菌数。该法适用于细菌，酵母菌和霉菌的孢子全菌数量的测定，故常称为全菌测定法。

5、滤膜法：该法主要用于生活饮用水细菌数的测定，一般用硝酸纤维制成滤膜，量取500ml水从滤膜上过滤，过滤后的滤膜培养一定的时间（24～48h）后取出，计算滤膜上的菌落数，根据菌落数即可计算出每毫升液体的菌体数。

三、测量微生物生长的方法

1、测定细胞物质增长的方法

①干重法：取一定容量的培养物，用离心或过滤的方法，将菌体从培养基中分离出来，洗净烘干、称重，求出培养物中的菌体质量，作为生长量的指标。霉菌生长量的测定常用此法。

②含氮量测定法：此法只适用于细胞浓度较高的样品，由于操作过程也较麻烦，故主要用于科学研究。

③比浊法：这是测定菌悬液中细胞数的快速方法。其原理是菌悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。此法简便，但使用时须注意样品颜色不宜太深，样品中不要混杂其他物质，同时菌悬液浓度必须在10⁷个/ml以上才能显示可信的混浊度。