微生物中沙门氏菌检测方法步骤
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 电子天平：感量 0.1 g。
2.6 无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。
2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌培养皿：直径 90 mm。
2.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。
2.10 无菌毛细管。
2.11 pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。
2.12 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）
3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液
3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂
3.5 HE 琼脂
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 三糖铁（TSI）琼脂
3.9 蛋白胨水、靛基质试剂
3.10 尿素琼脂（pH 7.2）
3.11 氰化钾 （KCN） 培养基
3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基
3.13 糖发酵管
3.14 邻硝基酚 β-D半乳糖苷（ONPG）培养基
3.15 半固体琼脂
3.16 丙二酸钠培养基
3.17 沙门氏菌 O和 H诊断血清。
3.18 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图 1。
5 操作步骤
5.1 前增菌
称取 25 g（mL）样品放入盛有 225 mL BPW的无菌均质杯中，以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质1 min～2 min，或置于盛有 225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若样品为液态， 不需要均质， 振荡混匀。 如需测定 pH值， 用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调pH 至 6.8±0.2。无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养8 h～18h。 如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于42 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
5.3 分离
分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板） 。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h～24 h （XLD琼脂平板、HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或 40 h～48 h （BS琼脂平板） ，观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表 1。
表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
沙门氏菌在亚硫酸铋琼脂(BS琼脂)上典型特征
沙门氏菌在HE琼脂上典型特征
沙门氏菌在XLD琼脂上典型特征
沙门氏菌在显色培养基上的典型特征
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 2。
表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试验） 、尿素琼脂 （pH7.2） 、氰化钾 （KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌落的平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
5.4.2.1 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有2 项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
5.4.2.2 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表 5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 抗原的准备
一般采用 1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如 2％～3％） 培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了 O凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有 0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管 1次～2次，自远端取菌培养后再检查。
5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定
同 5.5.2。
5.5.4 血清学分型（选做项目）
5.5.4.1 O抗原的鉴定
用 A～F 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。
被 A～F多价 O血清凝集者，依次用 O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和 O11 因子血清做凝集
试验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因子血清做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O抗原成分的最后确定均应根据 O单因子血清的检查结果，没有 O单因子血清的要用两个 O复合因子血清进行核对。
不被 A～F多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的 O群血清逐一检查，以确定 O群。每种多价 O血清所包括的 O因子如下：
O多价1 A，B，C，D，E，F，群 （并包括 6,14 群）
O多价2 13，16，17，18，21群
O多价3 28，30，35，38，39群
O多价4 40，41，42，43 群
O多价5 44，45，47，48 群
O多价6 50，51，52，53 群
O多价7 55，56，57，58 群
O多价8 59，60，61，62 群
O多价9 63，65，66，67 群
5.5.4.2 H抗原的鉴定
属于 A～F 各 O群的常见菌型，依次用表 6 所述 H因子血清检查第 1 相和第2 相的 H抗原。
表6 A～F群常见菌型 H抗原表
不常见的菌型，先用 8种多价 H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种 H因子血清逐一检查，以第1 相和第2 项的 H抗原。8 种多价 H血清所包括的 H因子如下：
H多价1 a，b，c，d，i
H多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51
H多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40
H多价4 1,2；1,5；1,6；1,7；z6
H多价5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38
H多价6 z39，z41，z42，z44
H多价7 z52，z53，z54，z55
H多价8 z56，z57，z60，z61，z62
每一个H抗原成分的最后确定均应根据 H单因子血清的检查结果， 没有 H单因子血清的要用两个 H复合因子血清进行核对。
检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的,可
在琼脂斜面上移种 1～2代后再检查。如仍只检出一个相的 H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下：
小玻管法： 将半固体管（每管约 1 mL～2 mL） 在酒精灯上溶化并冷至 50 ℃，取已知相的 H因子血清 0.05 mL～0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清 1：200～1：800 的量加入。
小倒管法：将两端开口的小玻管 （下端开口要留一个缺口，不要平齐） 放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至 50 ℃，挑取因子血清 1 环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种 1％软琼脂斜面，于 37 ℃培养后再做凝集试验。
简易平板法：将 0.35％～0.4％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清 1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
5.5.4.3 Vi抗原的鉴定
用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。
5.5.4.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果，按照附录 B 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。
本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 电子天平：感量 0.1 g。
2.6 无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。
2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌培养皿：直径 90 mm。
2.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。
2.10 无菌毛细管。
2.11 pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。
2.12 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）
3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液
3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂
3.5 HE 琼脂
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 三糖铁（TSI）琼脂
3.9 蛋白胨水、靛基质试剂
3.10 尿素琼脂（pH 7.2）
3.11 氰化钾 （KCN） 培养基
3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基
3.13 糖发酵管
3.14 邻硝基酚 β-D半乳糖苷（ONPG）培养基
3.15 半固体琼脂
3.16 丙二酸钠培养基
3.17 沙门氏菌 O和 H诊断血清。
3.18 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图 1。
5 操作步骤
5.1 前增菌
称取 25 g（mL）样品放入盛有 225 mL BPW的无菌均质杯中，以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质1 min～2 min，或置于盛有 225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若样品为液态， 不需要均质， 振荡混匀。 如需测定 pH值， 用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调pH 至 6.8±0.2。无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养8 h～18h。 如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于42 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
5.3 分离
分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板） 。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h～24 h （XLD琼脂平板、HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或 40 h～48 h （BS琼脂平板） ，观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表 1。
表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
沙门氏菌在亚硫酸铋琼脂(BS琼脂)上典型特征
沙门氏菌在HE琼脂上典型特征
沙门氏菌在XLD琼脂上典型特征
沙门氏菌在显色培养基上的典型特征
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 2。
表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试验） 、尿素琼脂 （pH7.2） 、氰化钾 （KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌落的平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
5.4.2.1 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有2 项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
5.4.2.2 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表 5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 抗原的准备
一般采用 1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如 2％～3％） 培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了 O凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有 0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管 1次～2次，自远端取菌培养后再检查。
5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定
同 5.5.2。
5.5.4 血清学分型（选做项目）
5.5.4.1 O抗原的鉴定
用 A～F 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。
被 A～F多价 O血清凝集者，依次用 O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和 O11 因子血清做凝集
试验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因子血清做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O抗原成分的最后确定均应根据 O单因子血清的检查结果，没有 O单因子血清的要用两个 O复合因子血清进行核对。
不被 A～F多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的 O群血清逐一检查，以确定 O群。每种多价 O血清所包括的 O因子如下：
O多价1 A，B，C，D，E，F，群 （并包括 6,14 群）
O多价2 13，16，17，18，21群
O多价3 28，30，35，38，39群
O多价4 40，41，42，43 群
O多价5 44，45，47，48 群
O多价6 50，51，52，53 群
O多价7 55，56，57，58 群
O多价8 59，60，61，62 群
O多价9 63，65，66，67 群
5.5.4.2 H抗原的鉴定
属于 A～F 各 O群的常见菌型，依次用表 6 所述 H因子血清检查第 1 相和第2 相的 H抗原。
表6 A～F群常见菌型 H抗原表
不常见的菌型，先用 8种多价 H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种 H因子血清逐一检查，以第1 相和第2 项的 H抗原。8 种多价 H血清所包括的 H因子如下：
H多价1 a，b，c，d，i
H多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51
H多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40
H多价4 1,2；1,5；1,6；1,7；z6
H多价5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38
H多价6 z39，z41，z42，z44
H多价7 z52，z53，z54，z55
H多价8 z56，z57，z60，z61，z62
每一个H抗原成分的最后确定均应根据 H单因子血清的检查结果， 没有 H单因子血清的要用两个 H复合因子血清进行核对。
检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的,可
在琼脂斜面上移种 1～2代后再检查。如仍只检出一个相的 H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下：
小玻管法： 将半固体管（每管约 1 mL～2 mL） 在酒精灯上溶化并冷至 50 ℃，取已知相的 H因子血清 0.05 mL～0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清 1：200～1：800 的量加入。
小倒管法：将两端开口的小玻管 （下端开口要留一个缺口，不要平齐） 放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至 50 ℃，挑取因子血清 1 环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种 1％软琼脂斜面，于 37 ℃培养后再做凝集试验。
简易平板法：将 0.35％～0.4％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清 1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
5.5.4.3 Vi抗原的鉴定
用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。
5.5.4.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果，按照附录 B 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。
