绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。它对人体致病，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症。因此，在化妆品标准中规定不得检出绿脓杆菌。

1．检验原理

其检查方法是根据绿脓杆菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外，还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42 ℃下生长等。可与类似菌相区别。

2． 仪器

培养箱、三角烧瓶、试管、灭菌平皿、灭菌刻度吸管、显微镜、载玻片、接种针或接种环、电炉、高压消毒锅。

  3．培养基和试剂

（1）  SCDLP液体培养基

制备方法与前述SCDLP液体培养基制备一致。

（2）  十六烷基三甲基溴化铵培养基：配方见表8-27所示。

表8-27  十六烷基三甲基溴化铵培养基配方

制备方法：除琼脂外，将上述物质混合加热溶解，调pH为 7.4～7.6，加入琼脂，在69 kPa压力下灭菌20 min后，制成平板，备用。_。

（3）乙酰胺培养基：配方见表8-28所示。

表8-28  乙酰胺培养基配方

制备方法：除琼脂和酚红外，将其它成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，在0.1 MPa压力下高压灭菌20 min后，制成平板，备用。

（4）绿脓菌色素测定用培养基：配方见表8-29所示。

表8-29  绿脓菌色素测定用培养基配方

制备方法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使之溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，在69 kPa压力下高压灭菌20 min后，制成斜面，备用。

（5）明胶培养基：配方见表8-30所示。

表8-30  明胶培养基配方

制备方法：取各成分加在蒸馏水中浸泡20 min，随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经在69 kPa压力下灭菌20 min后，直立制成高层，备用。

（6）硝酸盐蛋白胨水培养基：配方见表8-31所示。

表8-31  硝酸盐蛋白胨水培养基配方

制备方法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH值为7.2。煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，在69 kPa压力下灭菌20 min后，备用。

（7）普通琼脂斜面培养基：配方见表8-32所示。

表8-32  普通琼脂斜面培养基配方

制备方法：除琼脂外，其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2～7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，在0.1 MPa压力下高压灭菌15 min后，制成斜面,备用。

    4．检验步骤

（1）增菌培养：取1∶10样品稀释液10 mL加到90 mL SCDLP液体培养基中，置42 ℃培养箱中，培养（18～24）h，如有绿脓杆菌生长，培养液面会有一层薄菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色。如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基。检验含防腐剂的化妆品时，在每1000 mL普通肉汤中加1 g卵磷脂，7 g吐温80。

（2）分离培养：从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上。置37 ℃培养（18～24）h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落为扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延。表面湿润，菌落呈灰白色。菌落周围培养基常有水溶性色素扩散。此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。也可以用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平皿中，放37 ℃培养24 h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其它菌不生长。

（3）染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阳性者进行氧化酶试验。

（4）氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的10 g／L二甲基对苯二胺试液，在（15～30）s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，氧化酶试验阴性。

（5）绿脓菌素试验：取可疑菌落（2～3）个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，37 ℃培养24 h，加入氯仿（3～5）mL，充分振荡，使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中，并加入l mol／L的盐酸 l mL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。

（6）硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐胨水中，于37 ℃培养24 h，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸分解产生氮气。

（7）明胶液化试验：取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基中，于37 ℃培养24 h，取出放入冰箱（10～30）min，如仍是溶解状即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。

（8）42 ℃生长试验：提取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在（41～42） ℃培养箱中，培养（34～48）h，绿脓杆菌能生长，为阳性。近似的荧光假单胞菌则不能生长。

（9）检验结果报告：被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶，硝酸盐还原产气和42 ℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。