1、 首先配制营养肉汤培养基(配方 牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠 5g，加1L水，搅拌，配制用NaOH溶液配制成PH7.2-7.4这个不是很严格，在7附近都可以，别配成pH6或者pH8的话基本上问题不大。如果需要配成100ml的溶液，配方按照比例加就好了，如果需要配置成固体培养基，就需要在配好的液体培养基里添加2%的琼脂条或者琼脂粉，然后121度20分钟灭菌，需要说清楚的是1般250ml的摇瓶最终加100ml培养基或者更少)(用LB培养基替代营养肉汤培养基也是可以的，LB培养基配方 酵母提取物5g 蛋白胨10g 氯化钠 5g，别的都和上面说的一样)，需要注意的是配好的培养基灭菌时需要在摇瓶上加透气的塞子或者用8曾纱布包裹瓶口，然后外面在套上一层报纸。此时，也可以找几根小试管(长度差不多是10cm的那种)或者中号试管，每管加上述配好的培养基3ml(不加琼脂)，盖好盖子或者棉花塞，然后包上报纸一块灭菌，还有需要准备的就是1ml的大枪头、200微升的黄枪头、包好的(ep管最好包在饭盒里)1.5mlEp管、平皿(报纸包裹)、50%甘油，一起灭菌121度 20分钟，灭完菌除了培养基别的东西放烘箱里烘干。

2、添加琼脂的培养基等冷却到不烫手时(50-60度)，在超净工作台上倒到灭菌平板上，注意无菌操作，放好平板，自然冷却，可以多倒几块，不用的可以放到冰箱4度备用。

3、在酒精灯上烧接种环，等接种环冷却，蘸取你自己的菌液，在制作好的平板上划线(你可以找本微生物书看看怎么划单菌落，初次做注意手法轻重，容易把平板划破)，轻轻在固体培养基上划波浪线即可。然后放到37度烘箱倒置平板培养(一般12h左右即可见单菌落形成)

3、用灭菌的牙签或者灭菌小枪头挑取单菌落，接种至上述制作好的试管的培养基中，(可以多挑几个单菌落，每个分别接种到一管培养基中)37度摇床培养，差不多12h就可以了，此时可以明显看到试管中培养基浑浊。

4、此时得到几管大肠杆菌，如果需要扩大培养，可以按照1%接种量接种到100ml摇瓶中继续37度培养(如果你的原始的1ml大肠杆菌确定没有污染别的细菌，也可以直接接种0.5ml原始菌液至100ml培养基中，37度摇床培养，培养几个小时就可以看到培养基变得浑浊，就可以了)

5、菌液还需要保存，拿灭菌的ep管，在无菌条件下从试管中取1ml菌液到ep管中，然后再加0.5ml 50%甘油水溶液，混匀，直接放-20度或者-70度保存，可以保存1年没问题，用的时候去几十微升接种到试管中或者摇瓶中再培养就可以了。

培养条件不是很严格，温度30度以上大肠杆菌就可以生长，但是不能太高，一般37度是最适条件，摇床转速也不是特别严格，150左右即可，实在不行接种后静置培养也可以，此时大肠杆菌繁殖速度慢，培养时间也长，但也不会特别长。需要注意的东西就是所需材料的灭菌以及接种时操作以及无菌意识，初次做实验的学员经常会无意中碰到什么东西，导致自己的菌液染菌。

6、 甘油是最后加的，加甘油的目的是因为菌种保藏时要在-20或者-70保存，为了避免结冰时冰晶对细菌的损伤，所以添加15%到30%的甘油(最终和菌液混合后甘油的浓度)，此时甘油是作为保护剂使用的。

培养的时候添加甘油，此时甘油是作为营养物质被细菌利用了，如果细菌生长并且变浑浊了，这时候的菌液也是可以用的，但是因为不知道甘油被细菌利用了多少，所以作为菌种保存时不知道添加多少甘油。

可以再转接一次液体培养基，然后冷冻保存。