食品中亚硝酸盐的测定（分光光度法）
一、实验原理
亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法，使用分光光度计进行测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐的含量。
二、试剂
1、50g/L饱和硼砂溶液：准确称取5.0g硼酸钠，溶于100ml热水中，冷却后备用；
2、106g/L亚铁氰化钾溶液：准确称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000ml；
3、 220g/L乙酸锌溶液： 准确称取220.0g乙酸锌，先加30mL冰醋酸溶解，再用水稀释至1000ml；
4、4g/L对氨基苯磺酸溶液：准确称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100ml20%（V/V）的盐酸中，置于棕色瓶中混匀，避光保存；
5、2g/L盐酸萘乙二胺：准确称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100ml水中，混匀后，置于棕色瓶中，避光保存；
6、亚硝酸钠标准溶液(200ug/mL)：准确称取0.1000g于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀；
7、亚硝酸钠标准使用液(1.0ug/mL)：临用前，准确吸取亚硝酸钠标准溶液1.00 ml，置于200ml容量瓶中，加水稀释至刻度；
三、仪器
1、电子天平：感量0.1mg ；
2、电子天平：感量0.1g ；
3、HH-6数显恒温水浴锅 ；
4、752N紫外可见分光光度计。
四、分析步骤
1、提取
称取5.0g（准确到0.0001g）制成匀浆的试样，置于50ml的烧杯中，加12.5ml饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300ml将试样洗入500ml三角瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。
2、净化
将上述提取液倒入500ml的容量瓶中，加入5ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5ml乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30ml，滤液备用。
3、亚硝酸盐的测定
吸取40.0 ml上述滤液于50 ml具塞比色管中，另吸取0.00 ml，1.00 ml，2.00 ml，3.00 ml，4.00 ml，5.00 ml，7.50 ml，10.00 ml，12.50 ml，15.00 ml亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0ug，1.0ug，2.0ug，3.0ug，4.0ug，5.0ug，7.5ug，10.0ug，12.5ug，15ug亚硝酸钠），分别置于50ml带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2 ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入1 ml盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测其吸光度，绘制标准曲线比较，绘制标准曲线回归方程y=kx+b，亚硝酸钠标液浓度为x，吸度光为y，要求R2>0.990。
五、 结果计算
1、试样中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）含量计算公式：
A×1000
X（mg/kg）＝ —————————
m×V1/V2×1000
式中：
X：试样中亚硝酸钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A：测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为微克（ug）；
V1：测定用样液的体积，单位为毫升（ml）；
V2：试样处理液的总体积，单位为毫升（ml）；
m：试样的质量，单位为克（g）。
2．结果的准确度
分光光度法检测亚硝酸盐的检出限为1mg/kg，结果保留两位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法，使用分光光度计进行测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐的含量。
二、试剂
1、50g/L饱和硼砂溶液：准确称取5.0g硼酸钠，溶于100ml热水中，冷却后备用；
2、106g/L亚铁氰化钾溶液：准确称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000ml；
3、 220g/L乙酸锌溶液： 准确称取220.0g乙酸锌，先加30mL冰醋酸溶解，再用水稀释至1000ml；
4、4g/L对氨基苯磺酸溶液：准确称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100ml20%（V/V）的盐酸中，置于棕色瓶中混匀，避光保存；
5、2g/L盐酸萘乙二胺：准确称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100ml水中，混匀后，置于棕色瓶中，避光保存；
6、亚硝酸钠标准溶液(200ug/mL)：准确称取0.1000g于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀；
7、亚硝酸钠标准使用液(1.0ug/mL)：临用前，准确吸取亚硝酸钠标准溶液1.00 ml，置于200ml容量瓶中，加水稀释至刻度；
三、仪器
1、电子天平：感量0.1mg ；
2、电子天平：感量0.1g ；
3、HH-6数显恒温水浴锅 ；
4、752N紫外可见分光光度计。
四、分析步骤
1、提取
称取5.0g（准确到0.0001g）制成匀浆的试样，置于50ml的烧杯中，加12.5ml饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300ml将试样洗入500ml三角瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。
2、净化
将上述提取液倒入500ml的容量瓶中，加入5ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5ml乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30ml，滤液备用。
3、亚硝酸盐的测定
吸取40.0 ml上述滤液于50 ml具塞比色管中，另吸取0.00 ml，1.00 ml，2.00 ml，3.00 ml，4.00 ml，5.00 ml，7.50 ml，10.00 ml，12.50 ml，15.00 ml亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0ug，1.0ug，2.0ug，3.0ug，4.0ug，5.0ug，7.5ug，10.0ug，12.5ug，15ug亚硝酸钠），分别置于50ml带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2 ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入1 ml盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测其吸光度，绘制标准曲线比较，绘制标准曲线回归方程y=kx+b，亚硝酸钠标液浓度为x，吸度光为y，要求R2>0.990。
五、 结果计算
1、试样中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）含量计算公式：
A×1000
X（mg/kg）＝ —————————
m×V1/V2×1000
式中：
X：试样中亚硝酸钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A：测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为微克（ug）；
V1：测定用样液的体积，单位为毫升（ml）；
V2：试样处理液的总体积，单位为毫升（ml）；
m：试样的质量，单位为克（g）。
2．结果的准确度
分光光度法检测亚硝酸盐的检出限为1mg/kg，结果保留两位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
