菌落总数的测定和计数方法
一、菌落的概念和测定意义
菌落是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。
菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
二、菌落总数测定的作用
1.菌落总数的测定
是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20%)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
2.鉴于食品检样中的细菌细胞
是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数报告之。
3.每种细菌都有它一定的生理特性
培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。
三、检样稀释
1.检样稀释时，应以无菌操作称取(或量取) 样品25g(或m1)剪碎放于含有225ml灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成l：10的稀释液。
2.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述l：10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取1：10稀释液1ml与9ml稀释液混和做成l：100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1：1 000、1：10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换1支l ml灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。
3.从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分;而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分;因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。
4.在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm;吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。
5.当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。
四、平板接种与培养
1.将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lml稀释液加入皿内，最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2个平皿。
2.用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使融化，并保温于50±1℃恒温水浴中待用。倾注平皿时，每皿内倾入约15ml，最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。
3.为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。
4.检样与琼脂混和时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反的方向旋转，以使充分混匀。旋转中应加小心，不要使混和物溅到皿边的上方。为了保证混和均匀，而不溅及皿边的上方，可使用江苏省无锡县卫生防疫站童鹤泉设计制成的自动平皿旋转仪，直接将加有检样的平皿放在旋转仪上(可同时放4只平皿)，加入琼脂后，开动电钮，在数十秒钟内即可自动左右旋转而使皿内的检样与琼脂混合均匀。
5.皿内琼脂凝固后，不要长久放置，然后始翻转用报纸包扎培养;而应于琼脂凝固后，在数分钟内即应将平皿翻转予以培养，这样可避免菌落蔓延生长。必要时，可先将皿打开倒置(皿底向上)于温箱内经15~60分钟使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置于温箱内培养。
6.为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有l无受到来自空气的污染。
7.培养温度，应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。培养时间为48±2小时。其他食品，如清凉饮料，调味品，糖果、糕点.果脯，酒类(主要为发酵酒)、豆制品和酱腌莱均系用37℃、24±2小时培养。培养温度和时间之所以有这种不同的区分，乃是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。
五、菌落计数
1.从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。
2.计数菌落时，应选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定的标准。1个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数;如其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。如在一个稀释度的两个平板中，一个平板的菌落数在30一300之间，另一个大于300或小于30时，则以菌落数在30—300间的平板作为计数的标准。
3.菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告。
(1)若1个稀释度的平均菌落数在30—300之间，则将该菌落数乘其稀释倍数报告之，如表中例1，报告为164×102=16400，或1.6×104。
(2)若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数，如表中例2：46000/29500=1.6<2，故报告为：(46000+29500)/2=37750或3.8×l04。若大于2，则报告其中较小的数字，如表2-1中例3：60000/27l00=2.2>2，故报告为：27l00或2.7×104。若等于2，亦报告其中较小的数字，如表2-1中例4：3000/1500=2，故报告为：1500或1.5×l03.
(3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表中例5，报告为：313×108=313000或3.1×105。
4.注意事项
(1)如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验室事故。此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据。
(2)如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细菌块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。
(3)菌落计数中，如能使用菌落计数器，则比较方便，灯光由侧面射向平板，菌落易于观察。由于仪器带有电子音响讯号，用特制金属探笔点数中，在发出音响之下始显示数字增加，不会发生差错。且灯光与平板之间夹有多用方格玻质规板，也有助于对菌落密布的平板进行计数。
(4)每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。
菌落是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。
菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
二、菌落总数测定的作用
1.菌落总数的测定
是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20%)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
2.鉴于食品检样中的细菌细胞
是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数报告之。
3.每种细菌都有它一定的生理特性
培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。
三、检样稀释
1.检样稀释时，应以无菌操作称取(或量取) 样品25g(或m1)剪碎放于含有225ml灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成l：10的稀释液。
2.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述l：10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取1：10稀释液1ml与9ml稀释液混和做成l：100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1：1 000、1：10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换1支l ml灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。
3.从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分;而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分;因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。
4.在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm;吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。
5.当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。
四、平板接种与培养
1.将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lml稀释液加入皿内，最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2个平皿。
2.用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使融化，并保温于50±1℃恒温水浴中待用。倾注平皿时，每皿内倾入约15ml，最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。
3.为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。
4.检样与琼脂混和时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反的方向旋转，以使充分混匀。旋转中应加小心，不要使混和物溅到皿边的上方。为了保证混和均匀，而不溅及皿边的上方，可使用江苏省无锡县卫生防疫站童鹤泉设计制成的自动平皿旋转仪，直接将加有检样的平皿放在旋转仪上(可同时放4只平皿)，加入琼脂后，开动电钮，在数十秒钟内即可自动左右旋转而使皿内的检样与琼脂混合均匀。
5.皿内琼脂凝固后，不要长久放置，然后始翻转用报纸包扎培养;而应于琼脂凝固后，在数分钟内即应将平皿翻转予以培养，这样可避免菌落蔓延生长。必要时，可先将皿打开倒置(皿底向上)于温箱内经15~60分钟使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置于温箱内培养。
6.为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有l无受到来自空气的污染。
7.培养温度，应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。培养时间为48±2小时。其他食品，如清凉饮料，调味品，糖果、糕点.果脯，酒类(主要为发酵酒)、豆制品和酱腌莱均系用37℃、24±2小时培养。培养温度和时间之所以有这种不同的区分，乃是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。
五、菌落计数
1.从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。
2.计数菌落时，应选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定的标准。1个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数;如其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。如在一个稀释度的两个平板中，一个平板的菌落数在30一300之间，另一个大于300或小于30时，则以菌落数在30—300间的平板作为计数的标准。
3.菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告。
(1)若1个稀释度的平均菌落数在30—300之间，则将该菌落数乘其稀释倍数报告之，如表中例1，报告为164×102=16400，或1.6×104。
(2)若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数，如表中例2：46000/29500=1.6<2，故报告为：(46000+29500)/2=37750或3.8×l04。若大于2，则报告其中较小的数字，如表2-1中例3：60000/27l00=2.2>2，故报告为：27l00或2.7×104。若等于2，亦报告其中较小的数字，如表2-1中例4：3000/1500=2，故报告为：1500或1.5×l03.
(3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表中例5，报告为：313×108=313000或3.1×105。
4.注意事项
(1)如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验室事故。此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据。
(2)如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细菌块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。
(3)菌落计数中，如能使用菌落计数器，则比较方便，灯光由侧面射向平板，菌落易于观察。由于仪器带有电子音响讯号，用特制金属探笔点数中，在发出音响之下始显示数字增加，不会发生差错。且灯光与平板之间夹有多用方格玻质规板，也有助于对菌落密布的平板进行计数。
(4)每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。
